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結(jié)核分枝桿菌
引起結(jié)核病的病原菌
研究歷史
結(jié)核分枝桿菌
結(jié)核桿菌抗酸染色陽性(紅色）
結(jié)核分枝桿菌（M. tuberculosis）簡(jiǎn)稱為結(jié)核桿菌（tubercle bacilli）。早在1882年，德國(guó)細(xì)菌學(xué)家柯赫（Robert Koch，1843-1910）就已證明結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原菌。本菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見。隨著抗結(jié)核藥物的不斷發(fā)展和衛(wèi)生生活狀況的改善，結(jié)核的發(fā)病率和死亡率曾一度大幅下降。20世紀(jì)80年代后，由于艾滋病和結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應(yīng)用、吸毒、貧困及人口流動(dòng)等因素，全球范圍內(nèi)結(jié)核病的疫情驟然惡化。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界約每3個(gè)人中就有1個(gè)人感染了結(jié)核分枝桿菌，在某些發(fā)展中國(guó)家成人中結(jié)核分枝桿菌攜帶率高達(dá)80%，其中約5%～10%攜帶者可發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。近二十年 由于艾滋病的流行，感染了HIV的結(jié)核分枝桿菌攜帶者，由于病毒破壞了機(jī)體的免疫功能，發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且結(jié)核的病程發(fā)展更快。此外，在HIV感染的發(fā)展進(jìn)程中，結(jié)核是最早發(fā)生的一種機(jī)會(huì)性感染，結(jié)核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病負(fù)擔(dān)，使其更易死亡。21世紀(jì)以來全球每年約出現(xiàn)8百萬結(jié)核新病例，并導(dǎo)致約3百萬人死亡。中國(guó)每年死于結(jié)核病的人約25萬之多，是各類傳染病死亡人數(shù)總和的兩倍多。因此，結(jié)核病又成為了威脅人類健康的全球性衛(wèi)生問題，并成為某些發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)，特別是艾滋病高發(fā)區(qū)人群的首要死因。
生物學(xué)性狀
形態(tài)與染色
結(jié)核分枝桿菌為細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲的桿菌，大小1～4X0.4μm。牛分枝桿菌則比較粗短。分枝桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞壁脂質(zhì)含量較高，約占干重的60%，特別是有大量分枝菌酸（mycolic acid）包圍在肽聚糖層的外面，可影響染料的穿入。分枝桿菌一般用齊尼（Ziehl- Neelsen）抗酸染色法，以5% 石炭酸復(fù)紅加溫染色后可以染上，但用3%鹽酸乙醇不易脫色。若再加用美藍(lán)復(fù)染，則分枝桿菌呈紅色，而其他細(xì)菌和背景中的物質(zhì)為藍(lán)色。本菌無芽孢、無鞭毛。
結(jié)核分枝桿菌 抗酸染色 ×1000
結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)外經(jīng)青霉素、環(huán)絲氨酸或溶菌酶誘導(dǎo)可影響細(xì)胞壁中肽聚糖的合成，異煙肼影響分枝菌酸的合成，巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌后溶菌酶的作用可破壞肽聚糖，均可導(dǎo)致其變?yōu)長(zhǎng)型，呈顆粒狀或絲狀。異煙肼影響分枝菌酸的合成，可變?yōu)榭顾崛旧幮?。這種形態(tài)多形染色多變?cè)诜蝺?nèi)外結(jié)核感染標(biāo)本中常能見到。臨床結(jié)核性冷膿瘍和痰標(biāo)本中甚至還可見有非抗酸性革蘭陽性顆粒，過去稱為Much顆粒。該顆粒在體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中能返回為抗酸性桿菌，故亦為L(zhǎng)型。
培養(yǎng)特性
專性需氧。最適溫度為37℃，低于30℃不生長(zhǎng)。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的脂質(zhì)含量較高，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，故生長(zhǎng)緩慢。在一般培養(yǎng)基中每分裂1代需時(shí)18～24小時(shí)，營(yíng)養(yǎng)豐富時(shí)只需5小時(shí)。
結(jié)核桿菌菌落-羅氏培養(yǎng)基
抵抗力
掃描電子顯微鏡下的結(jié)核桿菌
變異性
結(jié)核分枝桿菌
強(qiáng)韌性
因結(jié)核桿菌體內(nèi)含有大量類脂質(zhì)，占結(jié)核菌干重的40%，細(xì)胞壁內(nèi)含量最多，因其富脂外壁的疏水性之故，一般的消毒劑難以滲入，對(duì)外界條件有異常大的抵抗力，使通常的滅菌方法易失敗，15%硫酸或15%氫氧化鈉溶液處理30分鐘，可殺死一般的病原菌，但不能殺死結(jié)核桿菌。在陰暗潮濕的地方可生存數(shù)月，在陽光暴曬下能生存數(shù)小時(shí)，在-7℃以下可生存4~5年。但在沸水中（100℃）數(shù)分鐘可死亡，因此，煮沸消毒是最有效最經(jīng)濟(jì)的方法。醇脂性溶劑———酒精能滲入其酯層而發(fā)揮奇效，用75%酒精2分鐘便可將它殺死。
條件性
結(jié)核分枝桿菌
懶惰性
結(jié)核桿菌生長(zhǎng)緩慢，無運(yùn)動(dòng)能力，性情懶惰，其最快分裂增殖速度為18小時(shí)一代，而大多數(shù)細(xì)菌都是幾分鐘或幾十分鐘便繁殖一代，如大腸桿菌約需20分鐘便可繁殖一代，10小時(shí)后，一個(gè)大腸桿菌繁殖10億個(gè)以上，可是一個(gè)結(jié)核桿菌18個(gè)小時(shí)才繁殖2個(gè)?？蓜e小看或輕視結(jié)核桿菌帶有這種欺騙性形似疲憊的懶惰行為，大量科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)務(wù)人員在臨床與它進(jìn)行長(zhǎng)期斗爭(zhēng)的實(shí)踐一再證明，我們與它斗爭(zhēng)的手段還沒有提高到一個(gè)高水平上來。
易發(fā)生耐藥性
結(jié)核分枝桿菌
近年來世界各地結(jié)核分枝桿菌的多耐菌株逐漸增多，甚至引起暴發(fā)流行。結(jié)核分枝桿菌的耐藥可由自發(fā)突變產(chǎn)生（原發(fā)性耐藥）或由用藥不當(dāng)經(jīng)突變選擇產(chǎn)生（繼發(fā)性耐藥）。但多耐的產(chǎn)生主要可能由于后者。耐藥基因在染色體上，對(duì)不同藥物的耐藥基因不相連接，所以聯(lián)合用藥治療有效。對(duì)異煙肼耐藥與katG基因丟失有關(guān)。易感株有該基因，耐藥株無。利福平主要作用于RNA多聚酶。編碼該酶的基因（rpoB）突變則引起對(duì)利福平耐藥。1999年國(guó)內(nèi)報(bào)道7株耐利福平株全部rpoB基因發(fā)生突變。敏感株則否。
致病性
結(jié)核分枝桿菌不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素。其致病性可能與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)大量繁殖引起的炎癥，菌體成分和代謝物質(zhì)的毒性以及機(jī)體對(duì)菌體成分產(chǎn)生的免疫損傷有關(guān)。
致病物質(zhì)
與莢膜、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)有關(guān)。
1.莢膜 莢膜的主要成分為多糖，部分脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。其對(duì)結(jié)核分枝桿菌的作用有：
①莢膜能與吞噬細(xì)胞表面的補(bǔ)體受體3（CR3）結(jié)合，有助于結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞上的粘附與入侵；
②莢膜中有多種酶可降解宿主組織中的大分子物質(zhì)，供入侵的結(jié)核分枝桿菌繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)；
③莢膜能防止宿主的有害物質(zhì)進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌，甚至如小分子NaOH也不易進(jìn)入。故結(jié)核標(biāo)本用4% NaOH消化時(shí)，一般細(xì)菌很快殺死，但結(jié)核分枝桿菌可耐受數(shù)十分鐘。結(jié)核分枝桿菌入侵后莢膜還可抑制吞噬體與溶酶體的融合。
2．脂質(zhì) 據(jù)實(shí)驗(yàn)研究細(xì)菌毒力可能與其所含復(fù)雜的脂質(zhì)成分有關(guān)，特別是糖脂更為重要。
結(jié)核分枝桿菌
②磷脂：能促使單核細(xì)胞增生，并使炎癥灶中的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>類上皮細(xì)胞，從而形成結(jié)核結(jié)節(jié)。
③硫酸腦苷脂（sulfatide）：可抑制吞噬細(xì)胞中吞噬體與溶酶體的結(jié)合，使結(jié)核分枝桿菌能在吞噬細(xì)胞中長(zhǎng)期存活。
3.蛋白質(zhì) 有抗原性，和蠟質(zhì)D結(jié)合后能使機(jī)體發(fā)生超敏反應(yīng)，引起組織壞死和全身中毒癥狀，并在形成結(jié)核結(jié)節(jié)中發(fā)揮一定作用。
所致疾病
結(jié)核分枝桿菌
⑴原發(fā)感染：多發(fā)生于兒童。肺泡中有大量巨噬細(xì)胞，少數(shù)活的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入肺泡即被巨噬細(xì)胞吞噬。由于該菌有大量脂質(zhì)，可抵抗溶菌酶而繼續(xù)繁殖，使巨噬細(xì)胞遭受破壞，釋放出的大量菌在肺泡內(nèi)引起炎癥，稱為原發(fā)灶。初次感染的機(jī)體因缺乏特異性免疫，結(jié)核分枝桿菌常經(jīng)淋巴管到達(dá)肺門淋巴結(jié)，引起肺門淋巴結(jié)腫大，稱原發(fā)綜合征。此時(shí)，可有少量結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入血液，向全身擴(kuò)散，但不一定有明顯癥狀（稱隱性菌血癥）；與此同時(shí)灶內(nèi)巨噬細(xì)胞將特異性抗原遞呈給周圍淋巴細(xì)胞。感染3～6周，機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫，同時(shí)也出現(xiàn)超敏反應(yīng)。病灶中結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁磷脂，一方面刺激巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為上皮樣細(xì)胞，后者相互融合或經(jīng)核分裂形成多核巨細(xì)胞（即朗罕巨細(xì)胞），另一方面抑制蛋白酶對(duì)組織的溶解，使病灶組織溶解不完全，產(chǎn)生干酪樣壞死，周圍包著上皮樣細(xì)胞，外有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，形成結(jié)核結(jié)節(jié)（即結(jié)核肉芽腫）是結(jié)核的典型病理特征。感染后約5% 可發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核，其中少數(shù)患者因免疫低下，可經(jīng)血和淋巴系統(tǒng)，播散至骨、關(guān)節(jié)、腎、腦膜及其他部位引起相應(yīng)的結(jié)核病。90% 以上的原發(fā)感染形成纖維化或鈣化，不治而愈，但病灶內(nèi)常仍有一定量的結(jié)核分枝桿菌長(zhǎng)期潛伏，不但能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫也可成為日后內(nèi)源性感染的淵源。
⑵原發(fā)后感染：病灶亦以肺部為多見。病菌可以是外來的（外源性感染）或原來潛伏在病灶內(nèi)（內(nèi)源性感染）。由于機(jī)體已有特異性細(xì)胞免疫，因此原發(fā)后感染的特點(diǎn)是病灶多局限，一般不累及鄰近的淋巴結(jié)，被纖維素包圍的干酪樣壞死灶可鈣化而痊愈。若干酪樣結(jié)節(jié)破潰，排入鄰近支氣管，則可形成空洞并釋放大量結(jié)核分枝桿菌至痰中。
1990國(guó)外報(bào)道各種類型肺結(jié)核，40%痰標(biāo)本檢出L型。近年來有人注意到病灶中見有形態(tài)不典型的抗酸菌卻未見典型結(jié)核結(jié)節(jié)，稱之為“無反應(yīng)性結(jié)核”。用結(jié)核分枝桿菌L型感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，也見有同樣情況。這是由于結(jié)核分枝桿菌L型缺少細(xì)胞壁脂質(zhì)成分，不能刺激結(jié)節(jié)形成，而僅有淋巴結(jié)腫大和干酪樣壞死。單從病理變化判斷，常被誤認(rèn)為慢性淋巴結(jié)炎。有人對(duì)155例曾診斷為慢性淋巴結(jié)炎蠟塊標(biāo)本作回顧性研究，用卡介苗抗體作免疫酶染色，68.9% 陽性，抗酸染色60%為抗酸顆粒。說明病例中很大一部分與結(jié)核分枝桿菌L型有關(guān)。臨床上對(duì)此應(yīng)予注意，以防漏診與誤診。
2.肺外感染 部分患者結(jié)核分枝桿菌可進(jìn)入血液循環(huán)引起肺內(nèi)、外播散，如腦、腎結(jié)核，痰菌被嚥入消化道也可引起腸結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎等。國(guó)外有報(bào)道332例血標(biāo)本僅2例培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌，但將此標(biāo)本注入豚鼠皮下 12% 感染結(jié)核。說明結(jié)核分枝桿菌在血中播散的大多不是一般細(xì)菌型，而是一種不易生長(zhǎng)的L型。近年有不少肺外結(jié)核的新報(bào)道，結(jié)核分枝桿菌的檢出率L型多于細(xì)菌型：如兒童結(jié)核性腦膜炎10例腦脊液培養(yǎng)，9例培養(yǎng)出L型，細(xì)菌型僅1例。老年性前列腺肥大排尿困難，術(shù)后病理切片抗酸菌L型占61.2%，無1例為典型抗酸桿菌。慢性前列腺炎常規(guī)培養(yǎng)陰性者，近1/3檢出抗酸菌L型。不育癥男子精液檢查單見抗酸桿菌7%，單見抗酸L型14%，電鏡檢查見L型吸附于精子頭、尾。以結(jié)核分枝桿菌L型感染小鼠，73% 睪丸間質(zhì)炎癥中見有抗酸菌L型。
免疫性
免疫機(jī)制
結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)感染菌，其免疫主要是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。T細(xì)胞不能直接和胞內(nèi)菌作用，必須先與感染細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞崩潰，釋放出結(jié)核分枝桿菌。機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌雖能產(chǎn)生抗體，但抗體只能與釋出的細(xì)菌接觸起輔助作用。結(jié)核分枝桿菌侵入呼吸道后，由于肺泡中80%～90% 是巨噬細(xì)胞，10% 是淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞占多數(shù)）；原肺泡中未活化的巨噬細(xì)胞抗菌活性弱，不能防止所吞噬的結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)，反可將結(jié)核分枝桿菌帶到他處。但可遞呈抗原，使周圍T淋巴細(xì)胞致敏。致敏淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生多種淋巴因子，如IL-2、IL-6、INF- γ，他們與TNF-α的共同作用可殺死病灶中的結(jié)核分枝桿菌。淋巴因子中INF-γ是主要的，有多種細(xì)胞能產(chǎn)生INF- γ，浸潤(rùn)的先后為NK、γ /δT和CD4+、CD8+α/βT細(xì)胞。上述細(xì)胞有的可直接殺傷靶細(xì)胞，有的產(chǎn)生淋巴因子激活巨噬細(xì)胞，使吞噬作用加強(qiáng)引起呼吸爆發(fā)，導(dǎo)致活性氧中介物和活性氮中介物的產(chǎn)生而將病菌殺死。機(jī)體內(nèi)的T細(xì)胞根據(jù)抗原受體（TCR）的不同可分2種：一種由α鏈與β鏈組成，稱α/βT細(xì)胞（含CD4或CD8標(biāo)志），另一種由? 鏈和δ鏈組成，稱γ /δT細(xì)胞（大多無CD4或CD8標(biāo)志）。人與小鼠外周血中前者 ?90%，后者<10%。在抗分枝桿菌免疫中這2種T細(xì)胞均起到重要作用。在感染早期α/βT細(xì)胞尚未升至高峰時(shí)，結(jié)核分枝桿菌受γ/δT細(xì)胞控制。在與結(jié)核分枝桿菌接觸后 γ /δT細(xì)胞即大量增殖。健康人經(jīng)分枝桿菌提取物刺激7～10d后，外周淋巴細(xì)胞中γ /δT細(xì)胞可有所增加，其作用與α/βT細(xì)胞同樣可殺傷結(jié)核分枝桿菌。近年來證明小鼠感染牛分枝桿菌后γ /δT細(xì)胞迅速匯集到炎癥區(qū)，增殖的主要是V 9δ2T細(xì)胞亞群，但人活動(dòng)性結(jié)核時(shí)此亞群有所下降。
近年來注意到γ /δT細(xì)胞攻擊的主要是分枝桿菌中的一種熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）。HSP是一種具有高度保守性的蛋白質(zhì)，從原核細(xì)胞到動(dòng)植物中均有，其氨基酸順序有50%同源。在正常生物中含量極少，但在感染、發(fā)熱、細(xì)胞惡變等外界環(huán)境條件改變時(shí)即大量產(chǎn)生，故HSP又稱應(yīng)激蛋白（stress protein）。HSP在許多病原菌中均有，其氨基酸序列有共同成分，不同細(xì)菌引起的亞臨床感染均可引起一定程度相同的免疫，被認(rèn)為是非特異性免疫。
結(jié)核的免疫屬于感染免疫（infection immunity），又稱有菌免疫，即只有當(dāng)結(jié)核分枝桿菌或其組分存在體內(nèi)時(shí)才有免疫力。一旦體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌或其組分全部消失，免疫也隨之不存在。
超敏反應(yīng)
隨著機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生保護(hù)作用的同時(shí)，也可以看到有遲發(fā)型超敏反應(yīng)的產(chǎn)生，二者均為T細(xì)胞介導(dǎo)的結(jié)果。從郭霍現(xiàn)象（Koch phenomenon）可以看到，將結(jié)核分枝桿菌初次注入健康豚鼠皮下，10～14d后局部潰爛不愈，附近淋巴結(jié)腫大，細(xì)菌擴(kuò)散至全身，表現(xiàn)為原發(fā)感染的特點(diǎn)。若以結(jié)核分枝桿菌對(duì)以前曾感染過結(jié)核的豚鼠進(jìn)行再感染，則于1～2d內(nèi)局部迅速產(chǎn)生潰爛，易愈合。附近淋巴結(jié)不腫大，細(xì)菌亦很少擴(kuò)散，表現(xiàn)為原發(fā)后感染的特點(diǎn)?？梢娫俑腥緯r(shí)潰瘍淺、易愈合、不擴(kuò)散，表明機(jī)體已有一定免疫力。但再感染時(shí)潰瘍發(fā)生快，說明在產(chǎn)生免疫的同時(shí)有超敏反應(yīng)的參與。近年來研究表明結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫和超敏反應(yīng)的物質(zhì)不同。超敏反應(yīng)主要由結(jié)核菌素蛋白和蠟質(zhì)D共同引起，而免疫則由結(jié)核分枝桿菌核糖體RNA（rRNA）引起。二種不同抗原成分激活不同的T細(xì)胞亞群釋放出不同的淋巴因子所致。
實(shí)驗(yàn)室診斷
結(jié)核菌素試驗(yàn)是應(yīng)用結(jié)核菌素進(jìn)行皮膚試驗(yàn)來測(cè)定機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌是否能引起超敏反應(yīng)的一種試驗(yàn)。
1.結(jié)核菌素試劑 以往用舊結(jié)核菌素（old tuberculin，OT）。系將結(jié)核分枝桿菌接種于甘油肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～8周后加熱濃縮過濾制成。稀釋2 000倍，每0.1ml含5單位。目前都用純蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）。PPD有二種：人結(jié)核分枝桿菌制成的PPD-C和卡介苗制成的BCG-PPD。每0.1ml含5單位。
2.試驗(yàn)方法與意義 常規(guī)試驗(yàn)分別取2種PPD 5個(gè)單位注射兩前臂皮內(nèi)，48～72h后紅腫硬結(jié)超過5mm者為陽性，≥15mm為強(qiáng)陽性，對(duì)臨床診斷有意義。若PPD-C側(cè)紅腫大于BCG-PPD側(cè)為感染。反之，BCG-PPD側(cè)大于PPD-C側(cè)，可能系卡介苗接種所致。
陰性反應(yīng)表明未感染過結(jié)核分枝桿菌，但應(yīng)考慮以下情況：①感染初期，因結(jié)核分枝桿菌感染后需4周以上才能出現(xiàn)超敏反應(yīng)；②老年人；③嚴(yán)重結(jié)核患者或正患有其他傳染病，如麻疹導(dǎo)致的細(xì)胞免疫低下；④獲得性細(xì)胞免疫低下，如艾滋病或腫瘤等用過免疫抑制劑者。為排除假陰性，國(guó)內(nèi)有的單位加用無菌植物血凝素（PHA）針劑，0.1ml含10μg作皮試。若24h紅腫大于PHA皮丘者為細(xì)胞免疫正常，若無反應(yīng)或反應(yīng)不超過PHA皮丘者為免疫低下。
結(jié)核菌γ干擾素釋放試驗(yàn)
細(xì)胞免疫介導(dǎo)的結(jié)核菌γ干擾素釋放試驗(yàn)（T-cell interferon gamma release assays，TIGRA，又稱IFNGRA或GRA）是近年來采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）法定量檢出受檢者全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的IFN-γ檢測(cè)釋放反應(yīng)，用于結(jié)核菌潛伏感染的診斷。IFN-γ為Thl細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，不但能夠反映機(jī)體結(jié)核的Thl細(xì)胞免疫情況，還與體內(nèi)結(jié)核菌的抗原含量密切相關(guān)。被結(jié)核分枝桿菌抗原致敏的T細(xì)胞在遇到同類抗原時(shí)能產(chǎn)生高水平的IFN-γ，因此被用于結(jié)核潛伏感染的診斷。
目前美國(guó)FDA已批準(zhǔn)的基于ELISA的QuantiFERON-TB（GIT-G）和歐洲使用的基于ELISPOT的T-Spot.TB，都是以早期分泌性抗原靶-6（ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白-10（CFP-10）為抗原的。其中，QFT-G又出現(xiàn)了一種用試管的改良方法，稱為QFT-GIT（QFT-inTube）。ESAT-6和CFP-10都是從短期培養(yǎng)的濾液中分離的低分子量蛋白質(zhì)，具有良好的免疫原性，而且它們是選自結(jié)核分枝桿菌基因組差異區(qū)1（region of difference，RD1）基因編碼的結(jié)核桿菌特異性蛋白。某些TIGRA試驗(yàn)除了上述2種抗原外，還常用TB7.7抗原。TB7.7是結(jié)核分枝桿菌基因組差異區(qū)13（RDl3）基因編碼的結(jié)核桿菌特異性抗原。這3種抗原在BCG和絕大部分環(huán)境分枝桿菌中都缺失（除外堪薩斯分枝桿菌、海水分枝桿菌和蘇加分枝桿菌），因此避免了與卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌抗原的交叉反應(yīng)。
TIGRA的敏感性和特異性都強(qiáng)于TsT，特別是在HIV感染者、自身免疫性疾病、老人和幼兒等免疫力低下人群的檢測(cè)中。全球有約1300萬人共同感染了HIV和結(jié)核桿菌。感染HIV的LTBI由于免疫缺陷，更容易從潛伏感染發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核。Jiang等對(duì)BCG計(jì)劃接種區(qū)域的100個(gè)HIV共感染患者用T-Spot.TB檢測(cè)，結(jié)果顯示T-Spot.TB對(duì)于有過BCG接種歷史的HIV共感染的LTBI檢測(cè)比TsT更敏感快速，而且特異性高。Balcells等發(fā)現(xiàn)，QFT-G比TST在診斷HIV的LTBI時(shí)更少受免疫抑制的影響。Stephan等發(fā)現(xiàn)，QFT-G和T-Spot.TB在檢測(cè)HIV患者的LTBI時(shí)比TST更敏感。QFT-G和T-Spot.TB的協(xié)同性很差，對(duì)于不同CD4細(xì)胞數(shù)量的患者有不同的結(jié)果。Aichelburg等發(fā)現(xiàn)，QFTGIT可以用于HIV-1感染者的活動(dòng)性肺結(jié)核檢測(cè)。
腫瘤壞死因子α（TNF-α）是一種促炎細(xì)胞因子，在多種自身免疫性疾病中起重要的病理作用。但是，抗TNF-α的治療會(huì)導(dǎo)致潛伏性肺結(jié)核轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒?dòng)性肺結(jié)核，而自身免疫性疾病患者由于免疫抑制。TST容易產(chǎn)生假陰性。研究顯示，QFT-G和T-Spot.TB在免疫介導(dǎo)炎癥疾?。↖MID）患者中檢測(cè)LTBI的敏感性和特異性都比TST高。終末期腎?。‥SRD）患者感染結(jié)核分枝桿菌的幾率比健康人高10～25.3倍。Lee等比較了QFT-G、T-Spot.TB和TsT在ESRD患者中LTBI的診斷，結(jié)果顯示QFT-G和T-Spot.TB的結(jié)果較類似，但TsT和QFT-G、T-Spot.TB的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差較遠(yuǎn)。T-Spot.TB的檢出率比QFT-G高（分別為46.9%和40.0%）。然而，也有研究顯示QFT-G由于有許多不確定性結(jié)果，因此不能用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎LTBI的檢測(cè)。
Bergamini等應(yīng)用QFT-G、QFT-GIT和T-Spot.TB技術(shù)對(duì)496個(gè)0-19歲的兒童和青少年LTBI進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種QFT檢測(cè)得出的結(jié)果更相似，QFT相對(duì)于T-Spot.TB在4歲以下兒童中得到的非確定性結(jié)果更多。Chun等研究顯示，QFT-GIT比TsT在診斷接種過BCG的兒童中LTBI的特異性更強(qiáng)。
上述研究表明，TIGRA在HIV共感染、自身免疫性疾病和免疫力低下的兒童中，對(duì)LTBI的檢出率更高。但是，TIGRA存在無法區(qū)分活動(dòng)期和潛伏期結(jié)核、需要抽血獲取淋巴細(xì)胞、要求專業(yè)的操作人員和具備相應(yīng)條件的實(shí)驗(yàn)室、樣品必須在采集后8h內(nèi)完成等缺點(diǎn)，現(xiàn)階段仍未能完全取代TsT。另外，現(xiàn)階段研究的樣本都非常小，也沒有診斷LTBI的金標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)于TIGRA還有待進(jìn)一步研究。
微生物學(xué)檢查法
結(jié)核病的癥狀和體征往往不典型，雖可借助X線攝片診斷，但確診仍有賴于細(xì)菌學(xué)檢查。
標(biāo)本
標(biāo)本的選擇根據(jù)感染部位?？扇√?、支氣管灌洗液、尿、糞、腦脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相應(yīng)部位分泌液或組織細(xì)胞。
直接涂片鏡檢
標(biāo)本直接涂片或集菌后涂片，用抗酸染色。若找到抗酸陽性菌即可初步診斷?？顾崛旧话阌肸iehl-Neelsen法。為加強(qiáng)染色，可用IK（intensified Kinyoun）法染色。將石炭酸復(fù)紅染色過夜，用0.5% 鹽酸乙醇脫色30s，則包括大多結(jié)核分枝桿菌L型也可著色。為提高鏡檢敏感性，也可用金胺染色，在熒光顯微鏡下結(jié)核分枝桿菌呈顯金黃色熒光。
濃縮集菌
先集菌后檢查，可提高檢出率。培養(yǎng)與動(dòng)物試驗(yàn)也必須經(jīng)集菌過程以除去雜菌。腦脊液和胸、腹水無雜菌，可直接離心沉淀集菌。痰、支氣管灌洗液、尿、糞等污染標(biāo)本需經(jīng)4% NaOH（痰和堿的比例為1:4，尿、支氣管灌洗液和堿的比例為1:1）處理15min，時(shí)間過長(zhǎng)易使結(jié)核分枝桿菌L型與非結(jié)核分枝桿菌死亡。尿標(biāo)本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于錐形量筒內(nèi)靜置，取沉淀物處理。處理后的材料再離心沉淀。取沉淀物作涂片染色鏡檢。若需進(jìn)一步作培養(yǎng)或動(dòng)物接種，應(yīng)先用酸中和后再離心沉淀。
分離培養(yǎng)
將經(jīng)中和集菌材料接種于固體培養(yǎng)基，器皿口加橡皮塞于37℃培養(yǎng)，每周觀察1次。結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，一般需2～4周長(zhǎng)成肉眼可見的落菌。液體培養(yǎng)可將集菌材料滴加于含血清的培養(yǎng)液，則可于1～2周在管底見有顆粒生長(zhǎng)。取沉淀物作涂片，能快速獲得結(jié)果，并可進(jìn)一步作生化、藥敏等測(cè)定和區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌。國(guó)內(nèi)學(xué)者已證明結(jié)核分枝桿菌L型可存在于血細(xì)胞內(nèi)或粘附于細(xì)胞表面。這種患者往往血沉加快，用低滲鹽水溶血后立即接種高滲結(jié)核分枝桿菌L型培養(yǎng)基能提高培養(yǎng)陽性率。
動(dòng)物試驗(yàn)
將集菌后的材料注射于豚鼠腹股溝皮下，3～4周后若局部淋巴結(jié)腫大，結(jié)核菌素試驗(yàn)陽轉(zhuǎn)，即可進(jìn)行解剖。觀察肺、肝、淋巴結(jié)等器官有無結(jié)核病變，并作形態(tài)、培養(yǎng)等檢查。若6～8周仍不見發(fā)病，也應(yīng)進(jìn)行解剖檢查。
快速診斷
一般涂片檢查菌數(shù)需5x10/ml，培養(yǎng)需1x10/ml，標(biāo)本中菌數(shù)少于此數(shù)時(shí)不易獲得陽性結(jié)果，且培養(yǎng)需時(shí)較長(zhǎng)。目前已將多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌DNA鑒定，每ml中只需含幾個(gè)細(xì)菌即可獲得陽性，且1-2d得出結(jié)果。操作中需注意實(shí)驗(yàn)器材的污染問題，以免出現(xiàn)假陽性。又細(xì)菌L型由于缺壁并有代償性細(xì)胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使細(xì)胞膜破裂釋出DNA，以致造成PCR假陰性。用組織磨碎器充分研磨使細(xì)胞破裂后，則可出現(xiàn)陽性。目前有條件的單位使用BACTEC法，以含14C棕櫚酸作碳源底物的7H12培養(yǎng)基，測(cè)量在細(xì)菌代謝過程中所產(chǎn)生的14C量推算出標(biāo)本中是否有抗酸桿菌，5～7d就可出報(bào)告。
近年來國(guó)內(nèi)外研究證明臨床各種類型的肺結(jié)核患者中40% 左右分離出L型。經(jīng)治療的結(jié)核病人細(xì)菌型消失，L型常持續(xù)存在。有空洞患者痰中已不排細(xì)菌型者，8% 左右仍可檢出L型。故有學(xué)者建議將多次檢出L型亦作為結(jié)核病活動(dòng)判斷標(biāo)準(zhǔn)之一，細(xì)菌型與L型 均轉(zhuǎn)陰才能作為痰陰性。
防治原則
預(yù)防
近20年國(guó)際組織提出控制結(jié)核病主要方法有：①發(fā)現(xiàn)和治療痰菌陽性者；②新生兒接種卡介苗。約 80% 獲得保護(hù)力。1940年代中國(guó)部分城市調(diào)查肺結(jié)核病死率200/10萬以上。解放后衛(wèi)生條件改善，1973～1977顯示病死率已下降至30/10萬。但1979年以來全國(guó)三次大規(guī)模抽樣檢查疫情下降很慢。1979～1990每年患病率遞降率2.8%，痰陽性遞降率為3.0%。目前死亡率19/10萬，仍為其他傳染病之和的2倍。衛(wèi)生部要求2000年新生兒卡介苗接種率達(dá)90%。據(jù)統(tǒng)計(jì)新生兒時(shí)接種過的人以后的發(fā)病率比未接種過的減少約80%。
卡介苗是活疫苗，苗內(nèi)活菌數(shù)直接影響免疫效果，故目前已有凍干疫苗供應(yīng)。新的核糖體RNA（rRNA）疫苗已引起關(guān)注，但尚處在試驗(yàn)階段。
治療
利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素為第一線藥物。利福平與異煙肼合用可以減少耐藥性的產(chǎn)生。對(duì)嚴(yán)重感染，可以吡嗪酰胺與利福平及異煙肼合用。1g干酪灶或空洞約含結(jié)核分枝桿菌106～10。每105～6菌可有1種耐藥突變產(chǎn)生，對(duì)2種耐藥需菌1011，故以2藥聯(lián)合應(yīng)用為宜。
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