樣品分選原理
流式細(xì)胞儀的分選功能是由細(xì)胞分選器來(lái)完成的。總的過(guò)程是:由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴,根據(jù)選定的某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選,而后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴充電,帶電液滴攜帶細(xì)胞通過(guò)靜電場(chǎng)而發(fā)生偏轉(zhuǎn),落入收集器中;其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉,某些類型的儀器也有采用捕獲管來(lái)進(jìn)行分選的。 穩(wěn)定的小液滴是由流動(dòng)室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號(hào)作用下發(fā)生振動(dòng)而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約數(shù)百μm。實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)公式f=v/4.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號(hào)頻率。其中v是液流速度,d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度,可能會(huì)改變分選效果。使分選的含細(xì)胞液滴在靜電場(chǎng)中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選+150V,或-150V;偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的,因此從參數(shù)測(cè)定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時(shí)間,一般為數(shù)十ms。精確測(cè)定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵,儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來(lái)產(chǎn)生延遲??筛鶕?jù)具體要求予以適當(dāng)調(diào)整。 (50)數(shù)據(jù)處理原理:FCM的數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析,至于對(duì)儀器給出的結(jié)果如何解釋則隨所要解決的具體問(wèn)題而定。
①數(shù)據(jù)顯示:FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖、二維點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。 直方圖是一維數(shù)據(jù)用作最多的圖形顯示形式,既可用于定性分析,又可用于定量分析,形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線。根據(jù)選擇放大器類型不同,坐標(biāo)可以是線性標(biāo)度或?qū)?shù)標(biāo)度,用“道數(shù)”來(lái)表示,實(shí)質(zhì)上是所測(cè)的熒光或散射光的強(qiáng)度。坐標(biāo)一般表示的是細(xì)胞的相對(duì)數(shù)。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞之間的關(guān)系是它的局限性。
二維點(diǎn)圖能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系。坐標(biāo)和坐標(biāo)分別為與細(xì)胞有關(guān)的兩個(gè)獨(dú)立參數(shù),平面上每一個(gè)點(diǎn)表示同時(shí)具有相應(yīng)坐標(biāo)值的細(xì)胞存在(圖10-3)??梢杂啥S點(diǎn)圖得到兩個(gè)一維直方圖,但是由于兼并現(xiàn)象存在,二維點(diǎn)圖的信息量要大于二個(gè)一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說(shuō)多個(gè)細(xì)胞具有相同的二維坐標(biāo)在圖上只表現(xiàn)為一個(gè)點(diǎn),這樣對(duì)細(xì)胞點(diǎn)密集的地方就難于顯示它的精細(xì)結(jié)構(gòu)。
流式細(xì)胞儀
圖10-2直方圖圖10-3二維點(diǎn)圖二維等高圖類似于地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點(diǎn)圖的不足而設(shè)置的顯示方法。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù),即“等高”。曲線層次越高所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。一般層次所表示的細(xì)胞數(shù)間隔是相等的,因此等高線越密集則表示變化率越大,等高線越疏則表示變化平衡。圖10-4給出了二維等高圖的樣式。
假三維圖是利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)二維等高圖的一種視覺(jué)直觀的表現(xiàn)方法。它把原二維圖中的隱坐標(biāo)—細(xì)胞數(shù)同時(shí)顯現(xiàn),但參數(shù)維圖可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)、傾斜等操作,以便多方位的觀察“山峰”和“谷地”的結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié),這無(wú)疑是有助于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的。圖10-5為假三維圖的示意圖。
圖10-4二維等高圖圖10-5假三維圖
列表模式其實(shí)只是多參數(shù)數(shù)據(jù)文件的一種計(jì)算機(jī)存貯方式,三個(gè)以上的參數(shù)數(shù)據(jù)顯示是用多個(gè)直方圖、二維圖和假三維圖來(lái)完成的??捎肔istMode中的特殊技術(shù),開(kāi)窗或用游標(biāo)調(diào)出相關(guān)部分再改變維數(shù)進(jìn)行顯示。例如,“一調(diào)二”就是在一維圖上調(diào)出二維圖來(lái);“二調(diào)一”就是從二維圖中調(diào)出一維圖來(lái)。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調(diào)出相應(yīng)窗口的直方圖的示意圖。
流式細(xì)胞儀
圖10-6從二維圖設(shè)窗調(diào)出直方圖示意上面簡(jiǎn)要地介紹了幾種數(shù)據(jù)顯示形式,在實(shí)際應(yīng)用中,可根據(jù)需要選擇匹配,以便了解和獲得盡可能多的有用信息。
②數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)分析的方法總的可分為參數(shù)方法和非參數(shù)方法兩大類。當(dāng)被檢測(cè)的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型技術(shù)時(shí)則多使用參數(shù)方法。數(shù)學(xué)模型可以是一個(gè)方程或方程組,方程的參數(shù)產(chǎn)生所需要的信息來(lái)自所測(cè)的數(shù)據(jù)。例如在測(cè)定老鼠精子的DNA含量時(shí),可以獲取細(xì)胞頻數(shù)的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數(shù)來(lái)描述這些數(shù)據(jù),則參數(shù)即為面積、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。方程的數(shù)據(jù)擬合則通常使用最小二乘法。而非參數(shù)分析法對(duì)測(cè)量得到的分布形狀不需要做任何假設(shè),即采用無(wú)設(shè)定參數(shù)分析法。分析程序可以很簡(jiǎn)單,只需要直觀觀測(cè)頻數(shù)分布;也可能很復(fù)雜,要對(duì)兩個(gè)或多個(gè)直方圖逐道地進(jìn)行比較。 逐點(diǎn)描圖(或用手工,或用描圖儀、計(jì)算機(jī)系統(tǒng))是大家常用的數(shù)據(jù)分析的重要手段。我們??梢杂脕?lái)了解數(shù)據(jù)的特性、尋找那些不曾預(yù)料的特異征兆、選擇統(tǒng)計(jì)分析的模型、顯示最終結(jié)果等。事實(shí)上,不經(jīng)過(guò)先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀觀察分析就決不應(yīng)該對(duì)這批數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值分析。從這一點(diǎn)來(lái)看,非參數(shù)分析是參數(shù)分析的基礎(chǔ)。
逐道比較工作量較大,但用直觀法很容易發(fā)現(xiàn)明顯的差異,特別是對(duì)照組和測(cè)試組。考慮到FCM的可靠性,要注意到對(duì)每組測(cè)量,都要有對(duì)照組,對(duì)照組可以是空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、或零時(shí)刻對(duì)照組等,具體設(shè)置應(yīng)根據(jù)整體實(shí)驗(yàn)要求而定。對(duì)照組和測(cè)試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯(cuò)誤解釋。順便指出,進(jìn)行比較時(shí)對(duì)曲線的總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行歸一化處理,甚至對(duì)兩條曲線逐道相減而得到“差結(jié)果曲線”往往是適宜的。 因?yàn)閿?shù)據(jù)分析往往和結(jié)果解釋關(guān)系十分密切,也就是說(shuō)和生物學(xué)背景相關(guān),因此具體的分析法和原理將在后面結(jié)合實(shí)例再介紹。