免疫熒光（特異性強(qiáng)、敏感性高的標(biāo)記技術(shù)）
次瀏覽 | 更新時(shí)間：2023-05-23
來源 ：網(wǎng)絡(luò)整理
精選百科
本文由作者推薦
免疫熒光
特異性強(qiáng)、敏感性高的標(biāo)記技術(shù)
免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。
技術(shù)特點(diǎn)
該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。
熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。
原理
免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。
直接法
將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。
間接法
如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。
標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷。
技術(shù)分類
⑴熒光抗體技術(shù)（熒光顯微鏡技術(shù)）
抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。
⑵免疫熒光測定技術(shù)
抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法
⑴熒光物質(zhì)
1）熒光色素
許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：
⑴異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490~495nm，最大發(fā)射光波長520~530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：
有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。
⑵四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：
最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。
⑶四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：
最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或對(duì)比染色。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。
⑵其他熒光物質(zhì)
1）酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基苯乙酸等。
常見熒光素
1)FITC
2)RB200
3)TRITC
4）鑭系：Eu、Tb
5)PE
6）其它
實(shí)驗(yàn)步驟
直接法測抗原
⑴基本原理
將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
⑵試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋
搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
⑶實(shí)驗(yàn)步驟
① 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。
② 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全復(fù)蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間（參考：30min）。
③ 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩。
⑤ 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：
（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對(duì)照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。
⑷注意事項(xiàng)
1）對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。
2）染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí)，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時(shí)間。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。
3）為了保證熒光染色的正確性，首次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
① 標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
② 特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光，陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。
4）一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。
間接法測抗體
⑴基本原理
染色程序分為兩步，第一步，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。
⑵試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋。
搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
⑶實(shí)驗(yàn)步驟
1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。
2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，復(fù)蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩。
4）取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。
5）將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
6）重復(fù)操作3。
7）取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再復(fù)以蓋玻片。
8）熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。
⑷注意事項(xiàng)
1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過長，會(huì)使熒光減弱。
2）每次試驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置以下三種對(duì)照：
① 陽性對(duì)照：陽性血清+熒光標(biāo)記物
③ 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物
3. 已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。
免疫熒光
免疫熒光相關(guān)的文章
大理白族自治州，中華人民共和國云南省下轄自治州，地處云南省中部偏西，東鄰楚雄州，南靠普洱市、臨滄市，西與保山市、怒江州相連，北接麗江市，東經(jīng)98°52′～101°03′，北緯24°41′～26°42′之間。截至2022年8月29日，大理州轄1市、8縣、3自治縣。州府駐地大理市下關(guān)，距昆明市331千米
法國大革命（法語：La Révolution Fran?aise，英語：The French Revolution）是法國發(fā)生激進(jìn)政治和社會(huì)變革的時(shí)期，始于1789年的三級(jí)會(huì)議，結(jié)束于1799年11月法國領(lǐng)事館的成立。法國大革命是法國人民反抗君主專制和階級(jí)特權(quán)的一場革命?！白杂?、平等、博愛”是革命的
巴爾干半島（Balkan Peninsula），是一個(gè)歷史和地理上的名詞，用以描述歐洲的東南隅位于亞得里亞海和黑海之間的陸地，詳細(xì)的范圍依照定義不同有許多種說法。巴爾干一詞是由土耳其語的“山脈”一詞派生出來的。
小米本詞條是多義詞，共25個(gè)義項(xiàng)禾本科狗尾草屬植物小米（學(xué)名：Setaria italica var. germanica?(Mill.) Schred.）又稱為粟，北方稱谷子，谷子脫殼為小米，其粒小，直徑1mm左右。小米是世界上最古老的栽培農(nóng)作物之一，起源于中國黃河流域，是中國古代的主要糧食作物。粟生長耐旱，品種繁多，俗稱“粟有五彩”，有白、紅、黃、黑、橙、紫等各種顏色的小米，也有黏性小米。中國
胰島素蛋白質(zhì)激素名稱胰島素(Regular insulin）可增加葡萄糖的利用，能加速葡萄糖的無氧酵解和有氧氧化，促進(jìn)肝糖原和肌糖原的合成和貯存，并能促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹荆刂铺窃纸夂吞钱惿?，因而能使血糖降低。此外，本品能促進(jìn)脂肪的合成。抑制脂肪分解，使酮體生成減少，糾正酮癥酸血癥的各種癥狀。能促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，抑制蛋白質(zhì)分解。本品和葡萄糖同用時(shí)，可促使鉀從細(xì)胞外液進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)。
尚可名片
這家伙太懶了，什么都沒寫！
作者
