短裸甲藻毒素（短裸甲藻毒素）

簡(jiǎn)介

短裸甲藻屬于裸甲藻目（Gymnodiniales），裸甲藻科（Gymnodiniaceae），裸甲藻屬（Gymnodinium）。短裸甲藻毒素（Brevetoxin，BTX）主要是由雙鞭甲藻（Karenia bravisbrevis）產(chǎn)生的一類(lèi)赤潮藻毒素，其他藻類(lèi)如劇毒岡比甲藻（Gambierdiscums toxincus）、褐胞藻（Chattonella）、卡盾氏藻（Chattonella antiqua）、海洋褐胞藻（Chattonella marina）、針胞藻（Fibrocapsa japonica）和赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）等也可產(chǎn)生BTX。

此類(lèi)毒素可富集到貝類(lèi)等生物體中，并導(dǎo)致消費(fèi)者產(chǎn)生諸如惡心、嘔吐、腹瀉、痙攣、支氣管收縮、麻痹、昏迷等神經(jīng)性中毒癥狀，因此也曾被廣泛稱(chēng)為神經(jīng)性貝毒（Neurotoxic Shellfish Poisoning，NSP）。不過(guò)，由于其他毒素如麻痹性貝毒（Paralytic Shellfish Poisoning，PSP）也可以導(dǎo)致消費(fèi)者出現(xiàn)神經(jīng)性中毒癥狀，所以原有的分類(lèi)方法已不能滿足管理和科研的需求。因此，2004年由聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和政府間海洋委員會(huì)共同組建的雙殼軟體生物毒素工作組，根據(jù)毒素的基本結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)對(duì)現(xiàn)有貝類(lèi)毒素進(jìn)行了重新分類(lèi)，從而將原有的神經(jīng)性貝毒命名為短裸甲藻毒素組毒素（Brevetoxin-group，BTX），簡(jiǎn)稱(chēng)為BTX毒素。產(chǎn)生該毒素的貝類(lèi)主要分布在美洲墨西哥灣沿岸及新西蘭豪拉基海灣等海域。

物化特性

從化學(xué)性質(zhì)上來(lái)看，BTX屬于聚醚類(lèi)的脂溶性藻類(lèi)毒素（Lipophilic Phycotoxins，LPs），具熱穩(wěn)定性，易溶解于甲醇、乙醚等非極性有機(jī)試劑，該特性導(dǎo)致這類(lèi)毒素在貝類(lèi)等生物體中的消除半衰期長(zhǎng)達(dá)數(shù)十天甚至數(shù)月。

短裸甲藻毒素及其衍生物分子結(jié)構(gòu)

墨西哥灣貝類(lèi)中的BTX代謝產(chǎn)物最初是通過(guò)對(duì)東方牡蠣（Crassostreavirginica）組織提取物和水華水體進(jìn)行分離發(fā)現(xiàn)的。隨后的研究表明純毒素，游離的PbTx-2主要在東方牡蠣中代謝，而游離的PbTx-3則主要以其原有的形態(tài)蓄積于牡蠣中。鑒定的東方牡蠣中PbTx-2的主要代謝產(chǎn)物包括還原產(chǎn)物PbTx-3，半胱氨酸硫氧化物結(jié)合物BTX-B2（之前在新西蘭貝類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的）和S-脫氧-BTX-B2。S-脫氧-BTX-B2可以穩(wěn)定的氧化成BTX-B2，用作貝類(lèi)的檢測(cè)和定量鑒定。

就穩(wěn)定性與構(gòu)型關(guān)系而言，A型毒素較B型穩(wěn)定。在干燥狀態(tài)下或在有機(jī)溶劑內(nèi)，A型毒素的結(jié)構(gòu)仍完整不變。該毒素具耐熱性，在300℃時(shí)仍保持穩(wěn)定。pH值變化對(duì)穩(wěn)定性影響大。當(dāng)pH< 2或>10時(shí)可加速><型毒素的分解。在0.1mol/L NaOH水溶液中，毒素可用A環(huán)內(nèi)醋的皂化而滅活。經(jīng)臭氧分解，或在氯水（aqueous chloride）中亦使毒素活性受影響。

在東方牡蠣中，BTX代謝物的消除率和與其相關(guān)的極性和疏水性不是一致的。PbTx-1和PbTx-2的半胱氨酸結(jié)合物屬于極性最強(qiáng)的BTX代謝物，而同時(shí)也是持續(xù)最久的。Plakas等假設(shè)認(rèn)為PbTx-1和PbTx-2與半胱氨酸蛋白的二分之一相結(jié)合，從而使半胱氨酸-BTX通過(guò)蛋白水解作用內(nèi)收而緩慢釋放。游離的半胱氨酸或包含肽段的半胱氨酸（如谷胱甘肽）也可與PbTx-1和PbTx-2結(jié)合。貝類(lèi)組織中半胱氨酸結(jié)合物最初快速消除的狀態(tài)表示此類(lèi)結(jié)合物可能形成于游離的半胱氨酸或谷胱甘肽結(jié)合物的分解作用。

BTX毒素三維分子靜電勢(shì)圖

短裸甲藻毒素分子軌道模擬分布圖

將優(yōu)化得到的7個(gè)化合物的空間結(jié)構(gòu)疊加在一起，發(fā)現(xiàn)它們末端4個(gè)環(huán)可以很好地重合，從倒數(shù)第五個(gè)環(huán)開(kāi)始，分子骨架出現(xiàn)彎曲，A型分子彎曲較小，近似直線型，而B(niǎo)型分子向上彎曲較大，這是由于B型H環(huán)構(gòu)象發(fā)生了不同程度的變化。可見(jiàn)分子骨架彎曲程度同各自的生物活性強(qiáng)弱是很好對(duì)應(yīng)的。因?yàn)锳型比B型活性高，因此A型構(gòu)象更適宜同受體結(jié)合。

BTX毒素空間結(jié)構(gòu)對(duì)比模擬示意圖

毒性

BTX-2（B型）是渦鞭毛藻產(chǎn)生最多的BTX毒素。當(dāng)然，其他一些藻類(lèi)，如古卡盾氏藻、海洋卡盾藻、針胞藻、赤潮異彎藻等也曾被報(bào)道可產(chǎn)生似BTX的生物毒素。BTX-2在貝類(lèi)等生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物主要是BTX-3、BTX-B1、BTX-B2、S-desoxy-BTX-B2、BTX-B3、BTX-B4和BTX-B5。因此消費(fèi)者食用受污染的貝類(lèi)和魚(yú)類(lèi)導(dǎo)致的中毒主要是由BTX毒素的代謝產(chǎn)物引起的，而非BTX毒素直接作用的結(jié)果。

BTX主要蓄積在東方牡蠣（Crassostreavirginica）、文蛤（Mercenaria）、峨螺（Busycon contrarium）、海扇（Austrovenus stutchburyi）、綠殼貽貝（Pernacanaliculus）等貝類(lèi)中。貝類(lèi)可通過(guò)攝食短裸甲藻細(xì)胞或從水中直接吸收BTX，并使其快速蓄積。牡蠣中的短裸甲藻水平較好地反映了短裸甲藻水華的進(jìn)展和強(qiáng)度。已證實(shí)BTX可在接觸了純的BTX和短裸甲藻培養(yǎng)物的貝類(lèi)中快速蓄積。在捕食雙殼貝類(lèi)的食肉峨螺中發(fā)現(xiàn)，貝類(lèi)中的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)移也是間接的。

BTX可在一些貝類(lèi)體內(nèi)進(jìn)行代謝。BTX代謝的第一例報(bào)道是1992～1993年在新西蘭爆發(fā)的NSP。幾年以后，美國(guó)發(fā)現(xiàn)的大范圍的BTX代謝證實(shí)是由接觸了短裸甲藻水華的貝類(lèi)產(chǎn)生的，此次水華發(fā)生于墨西哥灣。其后發(fā)現(xiàn)BTX的代謝在多種貝類(lèi)中都具有特征性。因?yàn)樵诙搪慵自逯蠦型BTX分布廣泛，所以最初從貝類(lèi)中分離和鑒定出的BTX代謝物是B型BTX。

BTX-2和BTX-3的小鼠急性毒性試驗(yàn)24 h半致死劑量分別為200mg/kg b.w.和170 mg/kg b.w.。小鼠腹腔注射BTX-B3 在劑量濃度在300mg/kg b. w.時(shí)不具有毒性，而B(niǎo)TX-B4和BTX-B5的最小致死劑量分別為100和300-500mg/kg b. w.。小鼠分別腹腔注射BTX-B2、BTX-3和S-desoxy-BTX-B2所產(chǎn)生的中毒癥狀基本相似。致死劑量毒素導(dǎo)致的癥狀主要包括：15min后不動(dòng)，死亡前呼吸麻痹，眼球突出，快速?gòu)梽?dòng)后腿；而亞致死劑量毒素則造成腹式呼吸速率先迅速上升后急劇下降，四肢完全癱瘓，但3-5h后運(yùn)動(dòng)能力恢復(fù)。在接下來(lái)的7d觀察期結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)進(jìn)一步病理異常。通過(guò)靜脈注射給藥，小鼠立即中毒死亡。

小鼠口服的半致死劑量只有BTX-2（6600 mg/kg b. w.）和BTX-3（520 mg/kg b. w.）的。口服給藥一般5h后才出現(xiàn)死亡，這與注射給藥可致急性死亡不同。口服毒性效力BTX-2比BTX-3要低一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。毒性效力差異主要是吸收率的不同引起的，而不是因?yàn)锽TX-2在經(jīng)過(guò)肝臟時(shí)進(jìn)行了第一次代謝。

人類(lèi)接觸短裸甲藻毒素有三個(gè)途徑：在赤潮期間，沿海形成之氣霧中雜有此種毒素，人類(lèi)通過(guò)呼吸道吸入后導(dǎo)致哮喘樣發(fā)作，類(lèi)似毒覃堿受體興奮之癥狀；赤潮毒化海洋環(huán)境污染了海洋魚(yú)貝類(lèi)，人類(lèi)因攝食污染短裸甲藻毒素的海鮮品而導(dǎo)致“神經(jīng)性貝中毒”。其中毒表現(xiàn)類(lèi)似CTX中毒，主要有消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；皮膚接觸含短裸甲藻毒素的海水，導(dǎo)致皮膚及粘膜出現(xiàn)刺癢及水疤等表現(xiàn)。盡管尚無(wú)中毒死亡的報(bào)道，但此毒素的嚴(yán)重致病性已被臨床及病理學(xué)家所證實(shí)。由于此種毒素可導(dǎo)致呼吸衰竭或心室纖顫，故對(duì)人類(lèi)的潛在致死性不容忽視。

發(fā)生NSP中毒的各地區(qū)對(duì)致毒貝類(lèi)和魚(yú)類(lèi)體內(nèi)BTX毒素的含量數(shù)據(jù)中，以1MU相當(dāng)于4μg，BTX-2計(jì)（貝類(lèi)中污染的BTX毒素含量多以MUs/100g為單位），致毒貝類(lèi)中BTX毒素的濃度從880至49000μgBTX-2/kg b.w.不等。Naar 等應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 法測(cè)定魚(yú)肉中的BTX毒素（以BTX-3為標(biāo)準(zhǔn)），濃度從580至6000μgBTX-3/kg b.w.。歐洲國(guó)家尚無(wú)關(guān)于BTX類(lèi)毒素在貝類(lèi)和魚(yú)類(lèi)中的限量標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)規(guī)定小鼠生物法安全標(biāo)準(zhǔn)為20 MUs/100g（0. 8 mgBTX-2/kg b. w.）。新西蘭和澳大利亞最高限量為20MUs/100g，未規(guī)定哪一類(lèi)BTX類(lèi)。

毒理

一般來(lái)說(shuō)，主要采用腹腔注射、靜脈注射、口服等方式研究BTX毒素在小鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)。有報(bào)道的僅限于BTX-2和BTX-3。結(jié)果表明，小鼠腹腔注射BTX-2和BTX-3，1h后血水平達(dá)到最高值，BTX-2組比BTX-3組先達(dá)到正常血水平的3倍，BTX-2在24h后主要以共軛半胱氨酸結(jié)合物的形式從尿液排出; 而采用靜脈注射BTX-3，毒素在1 min內(nèi)在血液循環(huán)中消失，24h后通過(guò)膽汁排泄進(jìn)入糞便; 若采用口服的方式，BTX-3快速且廣泛分散到各個(gè)器官，其中肝臟內(nèi)含量最高，最后主要伴隨尿液和糞便排出到體外，且兩種方式含量相差不大。

呼吸是BTX毒素引起神經(jīng)性中毒的主要方式之一，因此通過(guò)向小鼠氣管內(nèi)滴入3H標(biāo)記的BTX-3，研究該種方式引起的毒代動(dòng)力學(xué)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氣管內(nèi)80%毒素被迅速吸收，從肺進(jìn)入血液并被所有組織器官吸收。大部分的BTX-3從肺、肝臟和腎臟代謝迅速排出體外，另外20%的毒素分散到其他器官保留了7d。小鼠組脂肪、心臟、腸、腎臟、肝臟和肌肉的消除半衰期為28h，而大腦和睪丸大概需要90h。大約90%的毒素在96 h內(nèi)排出體外，其中11%從尿液、64%從糞便排出。

BTX毒素主要對(duì)呼吸和心肌功能有抑制作用，產(chǎn)生自發(fā)、反復(fù)的劑量依賴(lài)性肌肉收縮，造成束顫，抽搐或跳躍，與劑量顯著相關(guān)的呼吸速率下降，中樞和外周神經(jīng)的支氣管收縮。

若干研究結(jié)果表明，BTX毒素可致染色體體外斷裂。BTX-2可誘導(dǎo)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞染色體畸變。通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳發(fā)現(xiàn)用BTX-2、BTX-3和BTX-9 孵育人體淋巴細(xì)胞后DNA受損傷（鏈斷裂）。在BTX-2、BTX-3和BTX-6孵育人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat E6-1后也發(fā)現(xiàn)了DNA損傷。Leighfield等報(bào)告說(shuō)，通過(guò)吸入暴露，BTX-2誘導(dǎo)了大鼠肝細(xì)胞DNA損傷，表明BTX-2也可引發(fā)體內(nèi)染色體斷裂。

BTX是較強(qiáng)的鈉通道激活毒素，可以與鈉通道受體靶部位VI結(jié)合，開(kāi)啟興奮膜上的鈉通道，可以使細(xì)胞膜對(duì)鈉離子的通透性增強(qiáng)，活化電壓門(mén)控鈉通道，產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞去極化作用，引起神經(jīng)肌肉興奮的傳導(dǎo)發(fā)生改變，對(duì)鉀通道不起作用。因而，BTX具有胚胎毒性、發(fā)育毒性、免疫毒性、遺傳毒性和致癌作用等毒性效應(yīng)。

BTX毒素電泳圖

檢測(cè)方法

BTX毒素的分析法主要有小鼠生物法（Mousebioassay，MBA）、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（Cytotoxicity assays）、受體結(jié)合試驗(yàn)（Receptor binding assays）、放射免疫法（Radioimmunoassay，RIA）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）。其中，小鼠生物法是發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的分析方法，而高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法則是定性、定量和靈敏度最好的方法。

BTX毒素所用的小鼠生物法是由美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)建立（APHA，1970）。標(biāo)準(zhǔn)方法使用乙醚從貝類(lèi)中提取毒素，以MUs/100g貝肉為單位。1MU被定義為對(duì)體重為20g的小鼠腹腔注射粗提毒素使50%的小鼠在930min內(nèi)死亡的用量，相當(dāng)于4μgBTX-2。然而，一些研究指出乙醚并不能有效地提取BTX毒素（例如半胱氨酸結(jié)合物）。而且MBA方法的特異性、重現(xiàn)性和靈敏度都很差，不僅耗時(shí)太長(zhǎng)，而且容易受到其他內(nèi)源性化合物的影響，從而造成假陽(yáng)性結(jié)果。

對(duì)貝類(lèi)中的BTX毒素現(xiàn)已應(yīng)用多個(gè)端點(diǎn)和多種檢測(cè)方式進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)是基于BTX對(duì)鈉離子運(yùn)輸通道的作用。多采用神經(jīng)母細(xì)胞瘤，用藜蘆堿通過(guò)打開(kāi)鈉離子運(yùn)輸通道從而促進(jìn)鈉離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)用哇巴因（Na+/K+- ATP 酶抑制劑）阻斷鈉鉀離子泵活性。BTX毒素結(jié)合藜蘆堿打開(kāi)的鈉離子通道增加了離子流量。該細(xì)胞的生存力可以通過(guò)代謝溴化噻唑藍(lán)四氮唑成紫色結(jié)晶物質(zhì)的量測(cè)定，方法對(duì)貝類(lèi)中BTX-1的最低檢出限0.25mg/kg。但Dickey等人指出細(xì)胞毒性試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性差，應(yīng)用受到限制。

受體結(jié)合法是基于BTX毒素與鈉鹽傳輸通道受體的結(jié)合力差異。通常用于測(cè)定魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)中毒素含量的受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，原理是放射性3H-BTX-3與天然BTX毒素與受體結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制。從興奮性組織分離膜制備或通過(guò)全細(xì)胞制備用于試驗(yàn)。半胱氨酸結(jié)合物（BTX-B2和S-desoxy-BTX-B2）與鈉離子通道受體的結(jié)合能力比BTX-3弱3-10倍。受體結(jié)合法的定量限是30μgBTX-3/kg牡蠣勻漿。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）方法已被廣泛地用于貝類(lèi)、魚(yú)類(lèi)和藻類(lèi)BTX毒素的定性和定量分析。Dickey等對(duì)實(shí)驗(yàn)室間LC-MS/MS 法檢測(cè)數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行了研究。實(shí)際上，所有LC-MS/MS方法可以很容易的檢測(cè)出BTX-3加標(biāo)樣品，其含量水平比美國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢出限20MUs/100g或0.8 mgBTX-2/kg貝肉低出一個(gè)數(shù)量級(jí)。