主要成分
TRIzol
TRIZOL的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞,使細(xì)胞中的蛋白,核酸 物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì),但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase(RNA酶)。TRIZOL是從細(xì)胞和組織中提取總RNA的即用型試劑,在樣品裂解或勻漿過(guò)程中,TRIZOL能保持RNA完整性。加入氯仿后,溶液分為水相和有機(jī)相,RNA在水相中。取出水相,用異丙醇可沉淀回收RNA。
※0.1%的8-羥基喹啉可以抑制RNase,與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。
※異硫氰酸胍屬于解偶劑,是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑,可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失,導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解,核蛋白迅速與核酸分離。
※β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。
基本特點(diǎn)
Trizol試劑
Trizol試劑可以快速提取人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌不同組織的總RNA,該方法對(duì)少量的組織(50-100 mg)和細(xì)胞(5×106)以及大量的組織(≥1 g)和細(xì)胞(>107)均有較好的分離效果。TRIZOL試劑操作上的簡(jiǎn)單性允許同時(shí)處理多個(gè)的樣品。所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。TRIZOL抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。故而能夠作RNA 印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析和分子克隆。并且利用DNA、RNA和蛋白質(zhì)在不同溶液中的溶解性質(zhì),可以通過(guò)分層分別將不同層中的RNA(上層)、DNA(中層)、蛋白質(zhì)(下層)分離純化出來(lái),效率極好。Trizol試劑能促進(jìn)不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如,從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色,可見許多介于7 kb和15 kb之間不連續(xù)的高分子量條帶,(mRNA和hnRNA成分)兩條優(yōu)勢(shì)核糖體RNA條帶位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S),低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之間 (tRNA,5S)。當(dāng)抽提的RNA用TE稀釋時(shí)其A260/A280比值≥1.8
使用方法
該法從細(xì)胞中提取RNA——用勻漿器將組織磨碎,加入TRIzol處理組織。5分鐘后加入氯仿,以每分鐘12000轉(zhuǎn)離心5分鐘,樣品即分成水樣層、中間層和有機(jī)層。
※RNA存在于水樣層中,收集水樣層后可以通過(guò)異丙醇沉淀RNA來(lái)還原。
※在除去水樣層后,中間層中的DNA和蛋白質(zhì)也能相繼以沉淀的方式還原:乙醇能使中間層的DNA沉淀析出,在中間層中加入異丙醇能沉淀出蛋白質(zhì)。
每100ml TRIzol可以抽提100個(gè)六孔板中的樣品或100個(gè)50-80mg的組織樣品。無(wú)論樣品是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌組織,該方法對(duì)少量的組織(50-100mg)和細(xì)胞(約五百萬(wàn)個(gè))及大量的組織(≥1g)和細(xì)胞(超過(guò)一千萬(wàn)個(gè))均有較好的分離效果。
每一百萬(wàn)細(xì)胞用TRIzol抽提可得5-15微克RNA,每毫克組織用TRIzol抽提可得1-10微克RNA(產(chǎn)量因細(xì)胞和組織不同而異)。
TRIzol操作上的簡(jiǎn)便性允許其同時(shí)處理多個(gè)樣品,所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。
TRIzol抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白質(zhì)的污染,故而能夠作RNA 印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析和單分子克?。≒CR)。
※如果是用于PCR,當(dāng)兩條引物位于單一外顯子內(nèi)時(shí),建議用級(jí)聯(lián)擴(kuò)大的DNase I(Cat. No. 18068)來(lái)處理抽提的總RNA。
※TRIzol試劑能促進(jìn)不同種屬、不同分子量大小的多種RNA的析出。例如,從大鼠肝臟抽提的RNA經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色,可見許多介于7kb和15kb之間的不連續(xù)的高分子量條帶(mRNA和hnRNA成分),兩條優(yōu)勢(shì)核糖體RNA條帶位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S),低分子量RNA介于0.1和0.3kb之間 (tRNA,5S)。當(dāng)抽提的RNA用TE稀釋時(shí),其A260/A280比值≥1.8。抽提小RNA時(shí)宜-70℃沉淀過(guò)夜。
TRIzol對(duì)人體有害,使用時(shí)應(yīng)戴一次性手套,注意防止濺出。
⒈樣品的制備 當(dāng)樣品富含蛋白質(zhì),脂肪,多糖或是細(xì)胞外物質(zhì)例如肌肉,脂肪組織和植物的塊莖部分時(shí)可能需要一額外的分離步驟。勻漿化后在2—8°C的條件下以12,000×g的離心力離心10分鐘,移除勻漿中不溶解的物質(zhì),余下的沉淀中包含有細(xì)胞外膜,多糖,以及高分子量DNA,而上層的超浮游物含有RNA。在來(lái)自于脂肪組織的樣品中,大量的脂肪漂在最上層因而應(yīng)該除掉。在每一個(gè)個(gè)案中,將清亮的勻漿溶液轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中加入氯仿并繼續(xù)進(jìn)行下述的分離步驟。
⒉ 分離階段 將勻漿樣品在15—30°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。蓋緊樣品管蓋,用手用力搖晃試管15秒并將其在30°C下孵育2—3分鐘。在2—8°C下以不超過(guò)12,000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘。離心后混合物分成三層:下層紅色的苯酚-氯仿層,中間層,上層無(wú)色的水樣層。RNA無(wú)一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL容量的60%。
⒊ RNA的沉淀 將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中,如果希望分離DNA和蛋白,有機(jī)層同樣要予以保留。通過(guò)將水樣層和異丙醇混合來(lái)沉淀RNA。最初均化時(shí)的每1 ml TRIZOL對(duì)應(yīng)0.5 ml異丙醇。將混合的樣品在15—30°C條件下孵育10分鐘并在2—8°C下以不超過(guò)12,000×g的離心力高速冷凍離心10分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見,形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。
4 .RNA的洗脫 移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次,每1 ml的 TRIZOL至少加1 ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2—8°C下以不超過(guò)7,500×g的離心力高速冷凍離心5分鐘。
⒌ RNA的再溶解 在操作的最后,簡(jiǎn)單干燥RNA沉淀(空氣干燥或真空干燥5—10分鐘)不要在真空管里離心干燥RNA。尤為重要的是,不能讓RNA沉淀完全干燥那樣會(huì)極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無(wú)RNA酶的水或0.5% SDS溶液來(lái)溶解RNA,并在55—60°C下孵育10分鐘(當(dāng)RNA以后要用于酶切反應(yīng)時(shí),避免使用SDS。)RNA還能被100%甲酰胺(除去離子)再溶解并保存在–70°C。
RNA抽提注意事項(xiàng)
⒈從少量的組織(1—10 mg)或細(xì)胞(102—104)中分離RNA 樣品:往組織或細(xì)胞中加入800 μl TRIZOL。待樣品裂解后,加入氯仿并進(jìn)行步驟2中的抽提操作。在用異丙醇沉淀RNA之前,加入5—10μg無(wú)RNA酶的脂質(zhì)體(CatNo 10814)作為水樣層的載體。為降低其黏度在加入氯仿前用26號(hào)注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。脂質(zhì)體會(huì)留在水樣層中并和RNA共析出。在濃縮到4 mg/ml之前它不會(huì)抑制第一絲狀體的合成也不會(huì)抑制PCR。
⒉在勻化后和加入氯仿之前,樣品可以在–60—–70°C保存至少一個(gè)月。RNA沉淀(步驟4,RNA洗脫)溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周,在–5—–20°C下至少可保存一年。
⒊臺(tái)式離心機(jī)最大能達(dá)到2,600×g的離心力,如果將離心時(shí)間延長(zhǎng)到30-60分鐘可以滿足步驟2和步驟3中的操作。
配制方法
在2000ml的燒杯中加入以下物質(zhì),混合均勻:
500ml重蒸苯酚;
250g異硫氰酸胍;
293mL蒸餾水;
⒘6mL 0.75M 檸檬酸鈉溶液(pH≥7)
26.4mL 10%sarcosy(十二烷基肌氨酸鈉)溶液
50mL 2M NaAc溶液(pH≥4)
TRIzol需4℃低溫保存,保質(zhì)期約一年。100mL TRIzol試劑市場(chǎng)售價(jià)約478元人民幣。
注釋:⑴水和苯酚部分互溶,Trizol中苯酚被水飽和,形成均勻溶液;⑵NaAc等鹽類的作用是提供緩沖環(huán)境。
選擇
互溶,Trizol中苯酚被水飽和,形成均勻溶液;⑵