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核移植
基本信息
| 外文名 | Nuclear transfer |
| 應(yīng)用 | 醫(yī)學(xué) |
| 領(lǐng)域 | 細(xì)胞生物學(xué) |
具體方法
核移植
供體核的獲得
供體核可以是早期胚胎細(xì)胞、胚胎千細(xì)胞和體細(xì)胞。早期都采用合子核到64細(xì)胞期的胚胎細(xì)胞核質(zhì)體分裂球作供體細(xì)胞核，80年代開(kāi)始，隨著胚胎干細(xì)胞(embryo stem cells，ES)的建立和對(duì)其研究的深入，人們對(duì)胚胎干細(xì)胞在核移植方面的應(yīng)用前景寄予厚望，但ES建系太困難，僅在小鼠上獲得成功。Teruhiko Wakayama等利用ES系克隆小鼠，結(jié)果有29%的重構(gòu)胚在體外能發(fā)育到囊胚階段，移植給假孕小鼠有8%胚胎附植并產(chǎn)下小鼠。1997年Dolly羊的出現(xiàn)，開(kāi)始了體細(xì)胞的核移植，并發(fā)展很快。
1.1胚細(xì)胞
用0.2%鏈霉蛋白酶預(yù)處理胚胎，溶去胚胎的膠膜及透明帶，分離出單個(gè)卵裂球。消化透明帶的時(shí)間是影響卵裂球質(zhì)量的重要因素，作用時(shí)間短，透明帶不能充分消化，卵裂球不易獲得；作用時(shí)間長(zhǎng)，則影響到卵質(zhì)膜，容易破裂，在操作時(shí)容易失敗。因此，在分離卵裂球時(shí)應(yīng)在解剖鏡下監(jiān)視透明帶的消化過(guò)程，當(dāng)透明帶變薄，膨脹適度時(shí)就應(yīng)移出，再用適當(dāng)口徑的吸管吹打使之分離。另外，蘇格蘭學(xué)者Campbell等顯微分離胚盤(pán)細(xì)胞并在體外進(jìn)行缺血饑餓傳代培養(yǎng)，誘使細(xì)胞處于"靜止"狀態(tài)，以便調(diào)整染色體結(jié)構(gòu)，從而有助于核的重組與發(fā)育，他們使用這種方法建立了綿羊TNT4細(xì)胞系，該細(xì)胞形態(tài)類(lèi)似于胚胎干細(xì)胞，但更扁平、上皮化。
1.2體細(xì)胞
最早用青蛙腸粘膜上皮細(xì)胞獲得了后代。Wilmut等用綿羊乳腺細(xì)胞獲得Dolly羊。美國(guó)夏威夷大學(xué)Ryuzo Yanagimachi教授領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)國(guó)際科研小組于1998年以小鼠卵丘細(xì)胞為核供體，采用吸移管注入，利用機(jī)械和化學(xué)激活方式進(jìn)行細(xì)胞的融合，成功培育三代克隆小鼠。對(duì)小鼠、牛體細(xì)胞移植的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)休眠(G0)的顆粒細(xì)胞核與去核MⅡ期卵母細(xì)胞構(gòu)成的體細(xì)胞重構(gòu)胚，其發(fā)育率及產(chǎn)生克隆后代的能力遠(yuǎn)高于其它類(lèi)型的休眠體細(xì)胞，這可能緣于顆粒細(xì)胞上存在著與卵母細(xì)胞緊密聯(lián)系的胞質(zhì)微絨毛橋的緣故，它或許有助于供體核同受體核胞質(zhì)因子的交換。
受體細(xì)胞去核
作為細(xì)胞核移植的受體細(xì)胞主要有三類(lèi)：去核的卵母細(xì)胞、受精卵和2-細(xì)胞胚胎，其中卵母細(xì)胞應(yīng)用最為廣泛。有人用兩個(gè)去核卵母細(xì)胞融合后產(chǎn)生的胞質(zhì)作為受體進(jìn)行各代核移植，以增核移植胚胎的細(xì)胞數(shù)和提高繼代移植效率。研究證明，體外成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞核移植成功率不如體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，其原因可能是卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中，需要合成一些蛋白質(zhì)來(lái)完成第一次減數(shù)分裂，體外成熟的一些卵母細(xì)胞其活動(dòng)有可能受到抑制。
2.1卵母細(xì)胞的去核方法
2.1.1盲吸法用微細(xì)玻璃管在第一極體下盲吸，吸除第一極體及處于分裂中期的染色體和周?chē)牟糠旨?xì)胞質(zhì)，但該方法成功率低。為提高去核率，利用Hoechst33342染料對(duì)染色質(zhì)的特異性染色作用，在熒光顯微鏡下去核后判斷去核是否完成，去核準(zhǔn)確率大為提高。Stice等用Hoechst33342(1μg/ml)染色，在紫外線(xiàn)下照射的時(shí)間控制在10s以?xún)?nèi)，未觀察到對(duì)胚胎發(fā)育的負(fù)面影響。
2.1.2半卵法用微細(xì)玻管針在透明帶上做一切口后，用微細(xì)玻管吸去一半染色質(zhì)至另一半空透明帶內(nèi)，即將卵母細(xì)胞分為兩半，然后用Hoechst33342染色，確定不含染色體的一半為細(xì)胞質(zhì)受體。其操作方法如下，將卵母細(xì)胞移入35mm含有mPBSA(磷酸緩沖液，其中有D-葡萄糖1000mg/l、丙酮酸36mg/l、0.4%牛血清白蛋白、1%青霉素和鏈霉素10000μg/ml)的皮氏培養(yǎng)皿中進(jìn)行顯微操作，首先分兩步進(jìn)行分割透明帶，即先在透明帶上切一小口，然后用另一切割針擴(kuò)大切口，從而分割透明帶。透明帶被切除后轉(zhuǎn)移到含有mPBSA+5μg/ml細(xì)胞松弛素B的35mm的皮氏培養(yǎng)皿中作用3一5min，然后用固定針(內(nèi)徑為透明帶的l/5一1/3，外徑接近透明帶的直徑)固定，分割針進(jìn)入透明帶的隙口中并將該針固定在靠著透明帶的地方，緩慢吸取卵母細(xì)胞液，當(dāng)分割針中吸取了一半卵母細(xì)胞液時(shí)，這時(shí)將該針從卵黃隙中移出，并靠著透明帶切割邊緣輕微地擦過(guò)以達(dá)到完全的分割，將其針中的卵母細(xì)胞液移入準(zhǔn)備好了的空透明帶中，并用Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下觀察不發(fā)熒光的作為受體卵母細(xì)胞。
2.1.3離心去核Tatham等以15000g、2min離心牛卵母細(xì)胞，用鏈霉蛋白酶去除卵母細(xì)胞透明帶(ZP)，經(jīng)滲透壓梯度離心，MⅡ期紡錘體可從大多數(shù)卵母細(xì)胞中分開(kāi)，把無(wú)透明帶的去核胞質(zhì)作核移植的供質(zhì)，同分裂球聚集經(jīng)電融合成核移植胚，最后放入藻酸鈉假透明帶中，能在體外卵裂和發(fā)育，但其效果還有待于進(jìn)一步研究。
核移植
多數(shù)研究者在多數(shù)卵母細(xì)胞出現(xiàn)第一極體的成熟時(shí)期去核，去核時(shí)間，體內(nèi)成熟在發(fā)情開(kāi)始后48h，體外成熟22-24h。卵母細(xì)胞去核程序與重構(gòu)胚中再程序化狀況密切相關(guān)，去核率越高，其克隆胚最終發(fā)育成正常胚的可能性越大。去核率的高低與卵母細(xì)胞所處的成熟時(shí)期以及所采用的方法密切相關(guān)。以前的核移植研究均采用未激活的卵母細(xì)胞作為核受體，并認(rèn)為激活后卵母細(xì)胞的重排能力會(huì)下降，影響核移植的效率。但Ushijima，等和Terlovw等；研究表明，激活后的卵母細(xì)胞作為核供體時(shí)，重構(gòu)胚融合和發(fā)育能力均優(yōu)于融合激活同時(shí)進(jìn)行的效果。
2.3 胞質(zhì)容士與重構(gòu)胚的發(fā)育潛力
有人對(duì)核反比例與重構(gòu)胚發(fā)育的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明，卵母細(xì)胞去除的胞質(zhì)量與預(yù)期供核體積大小相當(dāng)時(shí)，可以為細(xì)胞周期的相互作用創(chuàng)造最好的條件，而去除太少或太多并不理想。基于去除細(xì)胞質(zhì)的量與去核率關(guān)系切，因此，在保證有較高的去核情況下。去除的胞質(zhì)應(yīng)盡量少。
核卵重組
在顯微操作儀操縱下，用一直徑接近卵裂球大的移植針吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去核的受體卵母細(xì)胞的間隙中，根據(jù)移人的部位不同，可分為帶下移植和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射。那些卵裂球很難分離的胚胎可以在添有鈣和鎂-游離的磷酸緩沖鹽溶液的mPBSA中孵育30-60min使細(xì)胞分裂停止。但孵育時(shí)間超過(guò)60min，細(xì)胞膜的完整性將遭到破壞，操作過(guò)程中細(xì)胞的溶化率將增加。在移植針移開(kāi)后，對(duì)移植卵裂球上方的透明帶施加壓力使卵裂球與半卵母細(xì)胞接觸。
細(xì)胞融合/激活
4.1 融合與激活
核移植
對(duì)兔卵電融合完成后，卵母細(xì)胞也因電刺激受到激活從而開(kāi)始新的編程和發(fā)育，但對(duì)小鼠、大鼠和牛等還需進(jìn)一步充分的激活才能獲得發(fā)育。其方法有化學(xué)和電激活兩種，化學(xué)激劑有7%乙醇、Ionomycin(離子霉素)、鈣離子載體A23187，采用Ionomycin激活后再用6-DMAP處理3h，可避免出現(xiàn)PCC(早熟染色體凝集)，并增加羊重構(gòu)胚的發(fā)育率及出生率。
4.2 融合率與細(xì)胞期
Prather等(1989)研究結(jié)果表明，融合率與細(xì)胞期無(wú)顯著差異，說(shuō)明卵裂球體積變小對(duì)融合率并無(wú)顯著的影響，張涌(1992)在小鼠研究中也得出類(lèi)似的結(jié)果。Robal等也認(rèn)為，融合率與受體卵母細(xì)胞的時(shí)齡有關(guān)，并且還與核供體接觸的面積和接觸的緊密程度有關(guān)，而與移入的卵裂球處于什么時(shí)期無(wú)關(guān)，但是重構(gòu)胚的發(fā)育率與供體胚的細(xì)胞期是有關(guān)的。
4.3 溫度、卵母細(xì)胞成熟時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞激活的影響
隨著卵母細(xì)胞在體外成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，進(jìn)而老化，成熟促進(jìn)因子(MPF)下降，易激活。體外成熟老化的牛卵母細(xì)胞對(duì)溫度誘導(dǎo)激活高度繁感，在一定的溫度誘導(dǎo)激活下，卵母細(xì)胞染色質(zhì)聚縮，"自動(dòng)去核"的頻率高。幼稚卵母細(xì)胞不容易在室溫下激活，即使激活也不穩(wěn)定，可能逆轉(zhuǎn)到中期。
重構(gòu)胚培養(yǎng)與移植
核移植
簡(jiǎn)要概述
核移植
鯽魚(yú)和鯉魚(yú)是經(jīng)常出現(xiàn)在人們餐桌上的兩種淡水魚(yú)。它們的親緣關(guān)系比較近。鯉魚(yú)幼小時(shí)常常會(huì)被誤認(rèn)為是鯽魚(yú)，如果沒(méi)有注意到它嘴巴邊上的兩根須的話(huà)。但從總體上說(shuō)，鯽魚(yú)和鯉魚(yú)的區(qū)別還是比較大的。鯽魚(yú)的個(gè)子小，長(zhǎng)到200～300克就不會(huì)再長(zhǎng)了；鯉魚(yú)是大個(gè)子，只要一兩年就能長(zhǎng)到兩三千克重。鯽魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩肥腴，鮮美可口；鯉魚(yú)的肉較粗較老，滋味比鯽魚(yú)遜。20世紀(jì)80年代初，中國(guó)武漢的一些生物科學(xué)工作者，進(jìn)行了一項(xiàng)大膽的試驗(yàn)。他們先對(duì)鯽魚(yú)的成熟卵細(xì)胞“動(dòng)手術(shù)”，設(shè)法去除掉它的細(xì)胞核。然后又從鯉魚(yú)的胚胎細(xì)胞中取出細(xì)胞核，讓它到上述的鯽魚(yú)細(xì)胞中“安家落戶(hù)”。在他們的精心操作之下，這種換掉了細(xì)胞核的鯽魚(yú)卵細(xì)胞就像正常的受精卵細(xì)胞一樣，開(kāi)始了不斷的分裂，最終發(fā)育成面目一新的雜交魚(yú)。這種魚(yú)一年就能長(zhǎng)到500克以上，但外觀形態(tài)和肉質(zhì)滋味都酷似鯽魚(yú)，只是嘴巴邊上多了兩根須。這是一次成功的細(xì)胞核移植。不難看出，細(xì)胞核移植和細(xì)胞融合一樣，能向人類(lèi)提供在大自然里是難以想象的動(dòng)植物新品種，從而帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。其實(shí)，在同種生物中使用細(xì)胞核移植技術(shù)也有巨大的價(jià)值，它能使性狀特別優(yōu)異的品種迅速得到推廣。道理很簡(jiǎn)單，生物個(gè)體的體細(xì)胞數(shù)量總要比生殖細(xì)胞多得多，而體細(xì)胞細(xì)胞核里的遺傳物質(zhì)則與生殖細(xì)胞是一模一樣的。當(dāng)人們發(fā)現(xiàn)了性狀特別優(yōu)異的動(dòng)植物體后，用細(xì)胞核移植技術(shù)，就可以把它大量的體細(xì)胞細(xì)胞核移植到同種生物的卵細(xì)胞里，培養(yǎng)出大量的性狀特別優(yōu)異的后代。
核移植
實(shí)際應(yīng)用
美國(guó)器官移植專(zhuān)家
核移植
異種器官移植
治療性克隆是利用核移植技術(shù)將病人的體細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，使其重編程并發(fā)育成囊胚，然后再用胚胎干細(xì)胞分離技術(shù)從克隆囊胚的ICM分離出多能胚胎干細(xì)胞（ES）。這種干細(xì)胞在遺傳學(xué)上和病人完全一致，再定向誘導(dǎo)其分化成病人所需要的體細(xì)胞進(jìn)行移植，以取代和修復(fù)患者已喪失功能的細(xì)胞、組織或器官，而達(dá)到完全治愈。治療性克隆不僅解決移植物與受者間的免疫排斥反應(yīng)問(wèn)題，而且可以解決移植物的來(lái)源問(wèn)題。
核移植科普?qǐng)D
核移植
到2007年為止，雖然核移植技術(shù)的發(fā)展較快，然而該技術(shù)還存在許多問(wèn)題，如核移植成功率普遍比較低、重構(gòu)胚的發(fā)育率低、畸形胚的比率高。體外培養(yǎng)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或培養(yǎng)液的成份可能導(dǎo)致移植胚的流產(chǎn)以及出生后的仔畜很快死亡?；蛑亟M編程的機(jī)制尚不清楚，其中MPF、NEBD（核膜破裂）和PCC在基因組重編過(guò)程的作用還需闡明。基因印記對(duì)核移植重新編程的影響以及基因印記與動(dòng)物克隆技術(shù)的成功及不足有何關(guān)系，還不清楚。
2001年我國(guó)科學(xué)家將牛耳細(xì)胞克隆的胚胎移入135頭牛體內(nèi)，每頭牛移植了兩枚克隆胚胎。從2002年1月8日起，陸續(xù)獲取了14頭克隆牛犢。至2003年11月，這批被克隆的牛，存活的只有5頭。
體細(xì)胞核移植技術(shù)在畜牧業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生，以及其它領(lǐng)域擁有著廣泛的應(yīng)用前景。
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