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ATP合成酶
廣泛分布于線粒體內(nèi)膜的蛋白酶
ATP合成酶，又稱FoF?-ATP酶在細(xì)胞內(nèi)催化能源物質(zhì)ATP的合成。在呼吸或光合作用過(guò)程中通過(guò)電子傳遞鏈釋放的能量先轉(zhuǎn)換為跨膜質(zhì)子(H)梯差，之后質(zhì)子流順質(zhì)子梯差通過(guò)ATP合酶可以使ADP+Pi合成ATP。
ATP合酶（ATP synthase）廣泛分布于線粒體內(nèi)膜，葉綠體類囊體，異養(yǎng)菌和光合菌的質(zhì)膜上，參與氧化磷酸化和光合磷酸化，在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的推動(dòng)下合成ATP。分子結(jié)構(gòu)由突出于膜外的F1親水頭部和嵌入膜內(nèi)的Fo疏水尾部組成。
概述
ATP合成酶
組成
ATP合酶主要由F?(伸在膜外的水溶性部分) 和Fo(嵌入膜內(nèi))組成(圖1)。不同物種來(lái)源的 ATP合酶含的亞基和數(shù)目不盡相同。以牛心線粒體 ATP合酶為例，它的F?含有僅α3、β3、γ、δ、ε共9 個(gè)亞基，F(xiàn)o含a、b2、C10共13個(gè)亞基，F(xiàn)?與Fo之間有OSCP柄相連接，還有抑制蛋白。線粒體F?Fo-ATP酶的總分子量約為500 ku。對(duì)大腸桿菌ATP合酶的研究較為詳盡，它的F?含5種亞基α、β、γ、δ、ε，分子量分別是55.3、50.3、31.6、19.3和14.9 ku。準(zhǔn)量關(guān)系為α3、β3、γ、δ和ε。F?的總分子量為382 ku。Fo由a、b、c 3種亞基組成，分子量分別為30.3、17.2和8.3 ku，準(zhǔn)量關(guān)系為a，b2，C9-12。Fo的總分子量約為164 ku，因此大腸桿菌F?Fo一ATP酶的總分子量共為546 ku。葉綠體ATP酶由CF?和CFo兩部分組成，它們的亞基的組成和分子量與上述兩種ATP合酶大體相似，但又有一定的差異。
結(jié)構(gòu)
ATP合酶結(jié)構(gòu)
F1由5個(gè)不同的亞基組成，用化學(xué)計(jì)量法表示是α3β3γ1δε1。通過(guò)對(duì)牛F1部分的X－Ray晶體衍射分析，得到了一個(gè)很確切的結(jié)構(gòu)—α3β3γ集合體。α和β亞基的三個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)輪流圍繞在γ亞基α螺旋結(jié)構(gòu)的氨基和羧基末端。此外，重要的是三個(gè)β亞基在結(jié)合核苷酸后會(huì)處于不同的狀態(tài)：βT,βD和βE。β亞基的不均勻性結(jié)構(gòu)與酶的接觸反應(yīng)部分相比，顯然是一致的。
F0是由三個(gè)亞基構(gòu)成，化學(xué)計(jì)量法表示是a1b2c10-12。c和a亞基的cAsp-61和aArg-210對(duì)質(zhì)子遷移分別獨(dú)立作用。同時(shí)提出了具有12個(gè)c亞基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且電子顯微鏡、原子粒顯微鏡也這樣提示，而且單個(gè)c亞基的核磁共振形成的模型擁有兩個(gè)跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)。
描述的是Escherichiacoli的F1F0結(jié)構(gòu)。蛋白是具有兩個(gè)方向的。F1部分包括α3，β3，γ，δ和ε亞基，F(xiàn)0部分包含a,b和c亞基，測(cè)定其化學(xué)含量比為1：2：10－14。F1和F0由兩個(gè)細(xì)莖連在一起，中心的一條連接γ和ε亞基，外圍的那條則旋繞δ和b亞基。在哺乳動(dòng)物，通常會(huì)有額外的亞基在細(xì)莖部位。
合成和水解
ATP合成酶位置
ATP合酶在線粒體內(nèi)膜上的分布不對(duì)稱，數(shù)量也不相等。
F1部分包含3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，在每一個(gè)β亞基上。當(dāng)少量的ATP增加時(shí)，這些結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)，底物結(jié)合的就非常緊密并且ATP的水解發(fā)生得非常緩慢。過(guò)量的ATP則導(dǎo)致其可結(jié)合在所有的結(jié)合位點(diǎn)上，并且伴隨產(chǎn)生的是在第二和第三個(gè)位點(diǎn)上具有很低的底物親和力。且第三位點(diǎn)的使用率若增加，ATP的水解率則增加104～105。
F1部分是一個(gè)有效的三倍復(fù)合體，由三個(gè)α亞基和β亞基組成，其具有與底物結(jié)合強(qiáng)的負(fù)協(xié)調(diào)性質(zhì)，同時(shí)亦具有酶活性的正協(xié)調(diào)性質(zhì)。為了解釋這些特殊的部分，Boyer提出“結(jié)合導(dǎo)致變化”或者稱為“抉擇位點(diǎn)”的假想。這則假想的關(guān)鍵特征是三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，和因此由三個(gè)α和β亞基配對(duì)形成的這些位點(diǎn)，在任何時(shí)期有不同的信息。一個(gè)開放并且準(zhǔn)備ATP（或者ADP＋Pi）結(jié)合，而第二和第三個(gè)位點(diǎn)則圍繞著一定的核苷酸，部分獨(dú)立的開放或者關(guān)閉。ATP結(jié)合物和開放位點(diǎn)關(guān)閉的結(jié)果可以產(chǎn)生協(xié)調(diào)信息的變化，其他的兩個(gè)位點(diǎn)也發(fā)生了改變，導(dǎo)致關(guān)閉的位點(diǎn)成為了部分開放，而部分開放的位點(diǎn)成為全部開放。如此，每個(gè)位點(diǎn)當(dāng)ATP水解時(shí)，在三個(gè)狀態(tài)下發(fā)生變化，在相反的過(guò)程中，即當(dāng)ATP合成時(shí)，同樣發(fā)生變化。一些構(gòu)象調(diào)節(jié)的細(xì)節(jié)表明三組αβ配對(duì)亞基一起同時(shí)被調(diào)控，然而對(duì)于在每一時(shí)期每一位點(diǎn)ATP合成或者分裂過(guò)程中，其反應(yīng)的中止仍然有爭(zhēng)議。
電子顯微鏡研究表明在α3β3構(gòu)成的環(huán)中，γ亞基具有旋轉(zhuǎn)性。這在80年代就已經(jīng)證明。這些分析令人信服的顯示了α和β亞基圍繞這個(gè)六邊體發(fā)生的改變，六邊體包含一個(gè)中心物質(zhì)，這已經(jīng)被認(rèn)定是γ亞基。
F1部分，化學(xué)能促使γ亞基旋轉(zhuǎn)。確切的結(jié)構(gòu)揭示了γ亞基與三個(gè)β亞基分別的相互作用。與結(jié)構(gòu)上的特征一致，γ亞基上的突變常常抑制ATP合成/水解，或者影響能量的配對(duì)，并且這些突變可受β亞基上的第二個(gè)突變抑制。此外，在氨基末端的突變也可受羧基端的突變抑制。類似的，羧基端的突變亦受氨基末端突變的抑制。然而這兩個(gè)區(qū)域并不直接的相互作用，所觀察到的現(xiàn)象是長(zhǎng)距離抑制現(xiàn)象，這提示在催化過(guò)程中，γ亞基的構(gòu)象有一個(gè)大的改變。
當(dāng)β亞基在催化過(guò)程中進(jìn)行一系列構(gòu)象的變化時(shí)（βTβDβE）），在α3β的六邊體里，γ亞基也相應(yīng)的改變著構(gòu)象。這種位置的改變最有可能的機(jī)制是γ亞基在六邊體里自我的旋轉(zhuǎn)所導(dǎo)致。γ亞基的旋轉(zhuǎn)已經(jīng)由一流的生物化學(xué)試驗(yàn)所提示，包括β/γ亞基的化學(xué)交聯(lián)，連接γ亞基的探針漂白后偏震現(xiàn)象的恢復(fù)，這些均已發(fā)現(xiàn)。ATP水解時(shí)的旋轉(zhuǎn)借助連接嗜溫的桿狀菌γ亞基的肌絲蛋白所記錄。在這個(gè)試驗(yàn)當(dāng)中，F(xiàn)1通過(guò)一個(gè)插入β亞基氨基末端的組氨酸標(biāo)簽固定在玻璃的表面。隨著旋轉(zhuǎn)，扭力發(fā)生，與生理學(xué)ATP水解釋放的自由能相比，扭力接近40～50pNnm。因此，αβ3γ復(fù)合物是一個(gè)將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)械能的有效的分子發(fā)動(dòng)機(jī)。
ATP合成過(guò)程
F0旋轉(zhuǎn)子的旋轉(zhuǎn)機(jī)制：依賴a亞基c環(huán)的活動(dòng)。與F1相比，ATP合成酶中另一個(gè)已經(jīng)很好詮釋的部分是F0，然而在基本的機(jī)械模型中，沒(méi)有一個(gè)能夠解決F0的結(jié)構(gòu)。目前F0結(jié)構(gòu)模型來(lái)源于核磁共振中測(cè)得的單個(gè)c亞基分子的結(jié)構(gòu)，并且同時(shí)參考酵母菌F1F0復(fù)合物部分X－Ray和原子粒顯微鏡研究數(shù)據(jù)得出模型結(jié)構(gòu)，所有的這些數(shù)據(jù)支持圖1中的環(huán)狀排列。對(duì)c亞基和a亞基之間的表面假設(shè)的質(zhì)子通道的研究，采用了突變的研究方法，并且證實(shí)c亞基的Asp61和a亞基的Arg210是質(zhì)子轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵氨基酸。
有的人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于細(xì)菌的F1F0可以像泵質(zhì)子一樣泵Na＋，簡(jiǎn)單的復(fù)合物研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶激活時(shí)，離子在遷移。另外通過(guò)致突變研究，去掉Na＋遷移，而Li＋或者H＋保留；現(xiàn)a亞基發(fā)生了一些改變。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在這個(gè)誘導(dǎo)的突變中，Na＋抑制了ATP的水解，這是因?yàn)殁c質(zhì)子通道陽(yáng)離子的吸引作用。這強(qiáng)有力的證明了F0部分時(shí)作為一個(gè)單獨(dú)的通道而起作用的。
對(duì)這個(gè)機(jī)制的任何細(xì)節(jié)上的解釋顯然都需要了解環(huán)上c亞基的數(shù)目，但是對(duì)其精確的測(cè)量證明是很困難的?？偨Y(jié)以往的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，c亞基的化學(xué)計(jì)量不同的種屬有不同的數(shù)據(jù)，并且依賴代謝條件，同一個(gè)個(gè)體都會(huì)不同。根據(jù)X－Ray數(shù)據(jù)，酵母菌有10個(gè)c亞基。做對(duì)照，原子粒顯微鏡發(fā)現(xiàn)P.modestum和葉綠體F0各自有11和14個(gè)。
探究及問(wèn)題
邏輯上很容易設(shè)想固定的部分和旋轉(zhuǎn)的部分可以互換，因?yàn)镕0F1沒(méi)有被固定在膜上。那么F1上固定的亞基如αβ，在旋轉(zhuǎn)子εγс0－12聚集時(shí)可以不動(dòng)。利用與上述相仿的實(shí)驗(yàn)，我們檢驗(yàn)了這個(gè)問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)只要εγс10－12聚集形成一個(gè)機(jī)械單位，肌絲的旋轉(zhuǎn)就會(huì)觀察到。借助遺傳工程，將α亞基和с亞基分別連接生物素標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽，這樣沒(méi)有化學(xué)能來(lái)獲得肌絲蛋白裝配的特殊性。裝配到α亞基的肌絲蛋白能夠在ATP水解時(shí)旋轉(zhuǎn)并且產(chǎn)生～40pNnm的扭力。這個(gè)現(xiàn)象是表明F0F1是一個(gè)旋轉(zhuǎn)酶的另外證據(jù)，并且α和с亞基復(fù)合物的旋轉(zhuǎn)是在質(zhì)子轉(zhuǎn)移和ATP水解/合成之間能量耦合的必備特征。
從上述可以看出，ATP合成酶是一個(gè)毫微發(fā)電機(jī)，它可以將化學(xué)能、滲透壓和機(jī)械能量互換。另外，還有一個(gè)未回答的問(wèn)題是，γ和с亞基的低聚合物旋轉(zhuǎn)子如何能夠從F1的接觸位點(diǎn)釋放出ATP并且通過(guò)F0逆向傳遞質(zhì)子？這需要我們進(jìn)一步的研究。
前景及展望
21世紀(jì)是納米科技的世紀(jì)。高集成、智能化納米器件的開發(fā)必將推動(dòng)信息技術(shù)、生物技術(shù)、新材料技術(shù)、能源技術(shù)及環(huán)境技術(shù)等的高速發(fā)展。納米技術(shù)是國(guó)際科技競(jìng)爭(zhēng)的前沿，也是對(duì)未來(lái)社會(huì)發(fā)展、經(jīng)濟(jì)振興、國(guó)力增強(qiáng)最有影響力的戰(zhàn)略研究領(lǐng)域。人工納米機(jī)器的構(gòu)建與應(yīng)用是此前沿領(lǐng)域國(guó)際上最具有挑戰(zhàn)性的熱點(diǎn)課題之一。
21世紀(jì)也是生命科學(xué)的世紀(jì)。生命活動(dòng)是自然界最精巧的運(yùn)動(dòng)方式，它賴以存在的基礎(chǔ)是生物大分子能夠響應(yīng)外界刺激(包括環(huán)境及外場(chǎng)條件的改變)。近20年來(lái)，分子生物學(xué)和單分子生物物理學(xué)所取得的突破性進(jìn)展揭示了生物分子馬達(dá)在生命過(guò)程中扮演著核心角色。這些過(guò)程包括ATP合成，基因轉(zhuǎn)錄、翻譯，物質(zhì)輸運(yùn)，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與分裂等。因此，科學(xué)界已全面確立了將蛋白酶理解為生物單分子機(jī)器的觀點(diǎn)。生物分子馬達(dá)的發(fā)現(xiàn)一方面使人們對(duì)生命的復(fù)雜有序有了新的認(rèn)識(shí)，另一方面也啟示和激發(fā)科學(xué)家去建造能與自然相媲美的納米機(jī)器。
面臨的問(wèn)題
(1)如何獲得Fo的精細(xì)結(jié)構(gòu)圖像；
(2)質(zhì)子通道c環(huán)與蛋白a之間的相互作用機(jī)制；
(3)質(zhì)子流向與馬達(dá)轉(zhuǎn)向的對(duì)應(yīng)切換機(jī)制；
(4)“轉(zhuǎn)子”γ軸的儲(chǔ)能機(jī)制；
(5)“定子”上的化學(xué)循環(huán)與“轉(zhuǎn)子”的步進(jìn)式轉(zhuǎn)動(dòng)之 問(wèn)如何實(shí)現(xiàn)高效的力學(xué)化學(xué)耦合；
(6)三個(gè)催化位點(diǎn)順序可逆的構(gòu)象變換：βo→←βL，βL→←βT和βT→←βo，與γ近距離的相互作用關(guān)系；
(7)三個(gè)催化位點(diǎn)全都結(jié)合核苷才能推動(dòng)馬達(dá)轉(zhuǎn)動(dòng) 還是只需要其中兩個(gè)結(jié)合；
(8)ADP和R與催化位點(diǎn)的結(jié)合和去結(jié)合是順序還是隨機(jī)的；
(9)催化位點(diǎn)聚合方向的構(gòu)象變化是否有利于ADP和Pi的結(jié)合，反之。水解方向的構(gòu)象變化是否有利于ATP的結(jié)合等。
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