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基本信息
| 外文名 | inclusion body |
| 別名 | 水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體 |
| 適用領域 | 重組蛋白的表達過程 |
| 范疇 | 生物學 |
正文
形成
在基因重組技術得到迅速發(fā)展之前，研究者就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)人工引入反常的蛋白質(zhì)（這些蛋白質(zhì)可以看作是細胞的外源蛋白質(zhì)），這些蛋白質(zhì)會堆積起來形成不溶的形式。這些蛋白質(zhì)聚集的形態(tài)是明顯的球形，這些球形的物質(zhì)全部是蛋白質(zhì)，并且通過非共價鍵的作用力形成，必須使用變性劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）或者鹽酸胍才能溶解。自從基因工程的蛋白質(zhì)在大腸桿菌表達以后，
人們逐漸發(fā)現(xiàn)這些外源蛋白質(zhì)基因在細胞中的過量表達同樣形成不溶性的狀態(tài)。
Georgiou等人發(fā)現(xiàn)天然的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中大量表達時，如內(nèi)酰氨酶和堿性磷酸酶的過量表達，都形成了包涵體，前者的包涵體在外周質(zhì)，后者的包涵體存在于細胞質(zhì)中。其它的宿主細胞中也發(fā)現(xiàn)了重組蛋白質(zhì)過量表達時形成的包涵體或者聚集體，如細菌病毒、哺乳動物細胞中。
包涵體在一些外界壓力下也可以形成，如溫度，是影響包涵體形成與否的主要因素。有些蛋白質(zhì)在高溫的情況下容易形成包涵體，這是由于這些蛋白質(zhì)在高溫下容易變性而形成聚集體。所以有人認為，當?shù)鞍踪|(zhì)具有高的融化溫度、高的天然構(gòu)象穩(wěn)定性的情況下，包涵體就不容易形成。但是，對一些體內(nèi)包涵體形成的研究發(fā)現(xiàn)，包涵體的形成先于成熟肽鏈的形成，或者是同時進行的。在研究P22尾刺蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)，盡管尾刺蛋白質(zhì)有高的穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)中主要是片斷，融化的溫度是88℃，并不受SDS、蛋白質(zhì)酶和熱失活的作用，但是這種蛋白質(zhì)是為數(shù)不多的在細胞內(nèi)形成包涵體的原核蛋白質(zhì)模型。有些天然的蛋白質(zhì)在高溫（391℃）表達時可以提高25%，但是這些蛋白質(zhì)不能折疊成天然的狀態(tài)而形成聚集體。聚集體形成的動力學表明，這些聚集體是從部分折疊的中間體形成的。實際上，這些折疊的中間體或者形成天然的狀態(tài)，或者形成聚集體，這個過程是溫度依賴性的，溫度的升高利于聚集體的形成。當?shù)鞍踪|(zhì)肽鏈在高溫下表達，合成的肽鏈足夠早地轉(zhuǎn)移到低溫下時，這些蛋白質(zhì)肽鏈會重新進入折疊的過程。同時，當尾刺蛋白質(zhì)在允許的溫度下表達后，再把細胞轉(zhuǎn)移到高溫下，這些蛋白質(zhì)肽鏈保持活性，證明了一旦蛋白質(zhì)被正確的表達并折疊成正確的構(gòu)象以后，則細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解性在高溫下不再改變。蛋白質(zhì)在體內(nèi)折疊的中間體對于溫度因子明顯敏感。
其它的發(fā)酵條件同樣影響蛋白質(zhì)包涵體的形成，發(fā)酵液中加入蔗糖可以大大降低內(nèi)酰胺酶包涵體的形成。蔗糖的作用可能是穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或者防止蛋白質(zhì)折疊中間體的聚集。在體外的內(nèi)酰胺酶折疊復性的過程中，同樣發(fā)現(xiàn)復性緩沖液中加入蔗糖可以提高蛋白質(zhì)的復性率。其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導熱休克蛋白質(zhì)的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl。也有報道認為在豐富的培養(yǎng)基中有利于活性蛋白質(zhì)的表達，當培養(yǎng)條件不佳時如供氧不足或pH控制不佳時易形成包涵體。
蛋白質(zhì)的聚集體和包涵體不僅僅存在于重組蛋白質(zhì)的表達中，是一個廣泛存在的現(xiàn)象。通常認為，蛋白質(zhì)的聚集現(xiàn)象，無論細胞內(nèi)還是細胞外，都是中間體不能完成折疊而形成自我聚集現(xiàn)象。包涵體的形成與多肽鏈的序列、表達速度、可用的伴侶分子的量以及生長的環(huán)境有關。
特點
包涵體
Zetlmeissl等人利用圓二色的方法，發(fā)現(xiàn)聚集體的肽鏈保持了部分的二級結(jié)構(gòu)。利用Raman測定的方法也得出了相同的結(jié)論。利用ATR-FTIR發(fā)現(xiàn)包涵體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比天然的蛋白質(zhì)和鹽沉淀的蛋白質(zhì)含有更多的非天然狀態(tài)的?折疊的結(jié)構(gòu)。Murry等人利用免疫學的方法測定色氨酸合成酶的亞基，蛋白質(zhì)復性以后，出現(xiàn)三種形式的蛋白質(zhì)：一種是不溶的高分子量的聚集體，一種是可溶的復性完全的蛋白質(zhì)，一種是可溶的低分子量的聚集體，最后一種聚集體同天然的蛋白質(zhì)一樣有免疫活性，可以與兩種單克隆抗體結(jié)合，但是天然蛋白質(zhì)的另外三種抗體不與它結(jié)合，說明了即使沒有復性，聚集體仍保持了部分的近似天然的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。
在大腸桿菌中，包涵體可以在細胞的兩個位置出現(xiàn)：細胞質(zhì)和外周胞質(zhì)。包涵體在細胞內(nèi)形成的位置和特點取決于蛋白質(zhì)表達的方式。三種表達的內(nèi)酰氨酶，一種是天然的內(nèi)酰氨酶，一種是含有OmpA信號肽，一種完全切除了天然蛋白質(zhì)的信號膚，當大量表達時，造成了聚集體的形成，前兩者的聚集體在外周胞質(zhì)，后者在細胞質(zhì)內(nèi)形成聚集。這些包涵體在大小和形狀有相當清楚的差別，這些差別表現(xiàn)了聚集體的表面形態(tài)、組成和形成聚集體的多肽鏈構(gòu)象上的不同。
大腸桿菌細胞質(zhì)中的包涵體直徑一般在0.2到1.5μm之間，不同的蛋白質(zhì)具有不同的直徑，如干擾素的大小是0.811μm，而牛凝乳酶原的大小是1.281μm。大的包涵體可以利用光學顯微鏡看得到。在一些情況下，有些包涵體比較大，直徑大于大腸桿菌的直徑，使得大腸桿菌有一個突起。一般情況下，一個細胞僅有一個包涵體。包涵體從來不吸附在膜上，并且不同于真核細胞中的其它的細胞器。高精度的投射電子顯微鏡顯示了多孔的結(jié)構(gòu)。
包涵體
聚集體的構(gòu)象還沒有進行系統(tǒng)的研究，但是已經(jīng)知道聚集在一起的作用力不是共價鍵，主要的是疏水相互作用力。大腸桿菌的細胞質(zhì)中有大量的谷胱甘肽，抑制二硫鍵的形成。所以，當?shù)鞍踪|(zhì)在細胞質(zhì)中表達時，由于形成不了二硫鍵而形成了聚集體。內(nèi)酰氨酶的包涵體進行蔗糖梯度離心表明其中95%是蛋白質(zhì)成分，說明很少有其他的蛋白質(zhì)成分加入到聚集體中，利用免疫學的方法，也沒有發(fā)現(xiàn)伴侶分子。體內(nèi)聚集體的形成不僅產(chǎn)生包涵體，而且會帶來淀粉質(zhì)的疾病，對哺乳動物同樣會造成疾病。
對體內(nèi)或者體外蛋白質(zhì)聚集體形成的研究，特別是了解氨基酸序列如何避免聚集體的形成，可以大大提高蛋白質(zhì)在體外折疊的收率，并且有助于理解體內(nèi)分子病形成的機制。
病毒包涵體
包涵體有的位于細胞質(zhì)中（如天花病毒包涵體），有的位于細胞核中（如皰疹病毒），或細胞質(zhì)、細胞核中都有（如麻疹病毒）。
有的包涵體還具有特殊名稱，如天花病毒包涵體叫顧氏（Guarnieri）小體，狂犬病毒包涵體叫內(nèi)基氏（Vegri）小體。昆蟲病毒可根據(jù)包涵體的形狀、位置而分為細胞質(zhì)型多角體病毒、核型多角及顆粒體病毒等。
分離
一旦一個穩(wěn)定的、重復的發(fā)酵過程建立起來，則要考慮提取包涵體的步驟了。包涵體處在細胞質(zhì)內(nèi)或者細胞的外周質(zhì)，必須破壞細胞膜才能把包涵體釋放出來。
包涵體
提取的第一步是冷卻發(fā)酵液，利用離心或者錯流過濾的方法收集細胞，細胞的沉淀利用設定的含有一定濃度的離子強度（0.4-0.6mo1）的緩沖液懸浮。這種緩沖液必須控制pH、離子強度、重金屬的濃度和氧化還原的環(huán)境，在以后的操作步驟中也要考慮這些因素。
由于包涵體比細胞可以耐受更大的剪切力，所以可以使用的破碎細胞的方法有很多。對于大腸桿菌，最經(jīng)常使用的方法是高壓勻漿的方法，可以使細胞完全破碎，并且這種方法可以以不同的規(guī)模使用，2到5個循環(huán)可以使細胞完全破碎。酵母細胞由于含有更加有彈力的細胞壁，所以需要的循環(huán)可能更多，或者在容器中加入一些玻璃顆粒。破碎細胞還可以使用物理的方法如超聲，或者化學的方法如化學試劑和酶，如溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）來破碎細胞。
包涵體可以使用過濾或者離心的方法，把細胞破碎液中的其它成分除去，這兩種方法利用了包涵體的不同物理特性。由于包涵體和可溶蛋白質(zhì)的體積不同，所以可以使用過濾的方法，這種方法可以降低操作成本，易于放大。一些實驗已經(jīng)證明過濾的方法是分離包涵體的有效的手段，但是這種方法也存在著一些缺點：過濾膜很容易被一些不透過的成分所堵塞，即使使用錯流過濾或者使用很高的流速，這種情況都不能避免。并且，由于微孔膜是根據(jù)成分的大小來分離的，一些細胞碎片也容易與包涵體混在一起。
而包涵體蛋白質(zhì)的密度比相同體積的細胞碎片的密度大得多，所以使用離心的手段可以把包涵體與細胞的其它成分分離開來。如果細胞碎片沒有同包涵體分離，在以后的分離手段中必須把膜上的組分分離開來。有時，有些目標蛋白質(zhì)以溶解的形式存在，可以通過在細胞破碎以前加入一些非極性的物質(zhì)（如苯酚、甲苯）或者去垢劑，通過這個方法可以提高從大腸桿菌表達的人生長激素包涵體的收率。
連續(xù)離心技術是工業(yè)生產(chǎn)中獲得包涵體最經(jīng)常使用的操作。由于細胞碎片的密度比包涵體小，則沉降的速度比包涵體要小，連續(xù)的懸浮、離心可以把大部分的包涵體離心下來，而細胞碎片逐步除去。SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳）分析發(fā)現(xiàn)，離心的方法可以達到沉降物中的蛋白質(zhì)的含量大于90%。
包涵體
離心和高壓勻漿都有可能產(chǎn)生泡沫，所以必須在工業(yè)規(guī)模中避免這種無謂的損失。有些工業(yè)生產(chǎn)中，分離以前在發(fā)酵罐中把細胞殺死使細胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來，并同時溶解或者不溶解包涵體蛋白質(zhì)。這種在線殺死細胞的方法己經(jīng)用來生產(chǎn)兩種蛋白質(zhì)：在堿性條件下溶解類胰島素生長因子和高溫、酸性條件下生產(chǎn)重組的抗真菌肽段。這種方法的優(yōu)點是可以節(jié)省操作時間以及能量消耗，僅僅需要一步離心的步驟。最經(jīng)常使用的殺死細胞的試劑有苯乙醇，辛酸，氯仿，甲苯等。殺死細胞時也有缺點，溶解的目標蛋白質(zhì)中含有蛋白質(zhì)或者非蛋白質(zhì)的物質(zhì)，降低了蛋白質(zhì)的純度；如果目標蛋白質(zhì)沒有被溶解，則殺死細胞會使可溶蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，使得包涵體的純化比較困難，或者破壞包涵體內(nèi)部的重組蛋白質(zhì)。
溶解
維持包涵體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力是分子內(nèi)的作用力，這種作用力也維持天然蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)。先前有報道這種作用力是共價鍵結(jié)合的，但是，現(xiàn)在趨向于一致，就是維持包涵體內(nèi)部的蛋白質(zhì)的緊密的結(jié)構(gòu)的是非共價鍵的作用力。二硫鍵，無論是正確的還是錯誤的二硫鍵，在維持內(nèi)部蛋白質(zhì)的緊密的結(jié)構(gòu)中都沒有發(fā)揮直接的作用。最經(jīng)常的獲得活性蛋白質(zhì)的第一步是溶解這些包涵體蛋白質(zhì)，溶解液是使這些包涵體蛋白質(zhì)完全變性的成分，當?shù)鞍踪|(zhì)被溶解以后，則進入到蛋白質(zhì)的體外折疊的過程。
包涵體
包涵體蛋白質(zhì)的溶解同樣是一個工藝的關鍵的步驟。溶劑的選擇會影響后續(xù)的操作、最終的各種蛋白質(zhì)的收率以及最終的成本，必須遵循以下的標準：
(1)快速溶解的動力學；
(2)與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可逆的；
(4)對溫度沒有依賴作用；
(5)抑制蛋白質(zhì)酶的降解作用；
(6)與蛋白質(zhì)的氨基沒有化學修飾作用；
(7)在可能的情況下，選擇最低的溶解濃度和廉價的溶劑，并適于以后的復性方法。
2. 溶解包涵體的試劑
最經(jīng)常使用溶解包涵體的試劑包括離液劑或者去垢劑。
最經(jīng)常使用的溶解和制備蛋白質(zhì)的離子型的離液劑最早于1969年Hatefi等人發(fā)展的離子型的去垢劑如SDS是另外一種溶解包涵體蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)的試劑，但是一般不用來大規(guī)模的生產(chǎn)，而是用來定性。除了強酸、強堿和利用有機溶劑來提取疏水性很強的蛋白質(zhì)以外，其他的變性方法如非可逆的共價修飾在工業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)中很少用到。一旦蛋白質(zhì)被溶解，蛋白質(zhì)中的巰基很容易快速地氧化并形成共價的聚集體或者分子內(nèi)錯配的二硫鍵，然后這些蛋白質(zhì)就不能再進行折疊。為了防止氧化，可以使這些基團或者利用緩沖液中含有低分子量的疏基試劑保持在還原的狀態(tài)或形成磺酸鹽或者形成混合的二硫鍵。
包涵體
去垢劑是一種最經(jīng)濟的溶解包涵體蛋白質(zhì)的方法，一個最大的優(yōu)點是溶解的蛋白質(zhì)有可能保持全部的生物活性，說明在此條件下保持了蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。最重要的是稀釋以后蛋白質(zhì)的聚集比其它溶劑生成的很少。陽離子型、陰離子型的和非離子型的去垢劑都可以使用，使用時的濃度一般高于去垢劑的臨界膠束濃度（CMC ），通常是0.5-5%。
SDS僅僅在大量生產(chǎn)牛生長激素、干擾素和白介素-2中用到。SDS由于具有較低的臨界膠束濃度（CMC）而使得結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的SDS比較難于除去。由于N-十二烷肌氨酸它的CMC比SDS高0.4%，也被用來溶解包涵體蛋白質(zhì)并可用稀釋的方法使蛋白質(zhì)復性，殘余的去垢劑可以使用陰離子交換色譜或者超濾的方法除去。這種去垢劑是一種比較溫和的去垢劑，可以選擇性地溶解一些包涵體，但是不能溶解完全的變性的蛋白質(zhì)的聚集體和大腸桿菌的內(nèi)膜的蛋白質(zhì)分子。使用去垢劑一個主要的缺點是對以后的純化和復性的步驟的干擾，去垢劑結(jié)合到蛋白質(zhì)上的強度大離子交換色譜復性蛋白質(zhì)小不同，比較難于除去，并干擾離子交換和疏水相互作用色譜的過程，在變性的濃度時超濾膜會吸附這些變性劑。所以復性后需要盡量洗滌這些去垢劑，也可以使用環(huán)狀糊精鏈狀糊精或者環(huán)狀淀粉從復性緩沖液中提取去垢劑。
一個不容忽視的問題是去垢劑可以溶解全部的膜蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)酶，這些蛋白質(zhì)酶的活性在去垢劑的存在的情況下被活化，可能造成溶解和復性過程的收率的降低。蛋白質(zhì)復性的收率可以通過以下的方法來提高：
a)先期使用可以溶解膜蛋白質(zhì)但是不溶解包涵體蛋白質(zhì)的溶劑盡量洗滌包涵體蛋白質(zhì)；
b)包涵體的含有的菌體碎片被完全除去；
c)溶解包涵體的液體中含有蛋白質(zhì)酶的抑制劑，如EDTA，苯甲基磺酰氟（PMSF ）等。
（2）離液劑
其它的離液劑也被用來溶解包涵體蛋白質(zhì)，最主要的溶解包涵體蛋白質(zhì)的離液劑是鹽酸胍和尿素，這是最經(jīng)常使用的溶解試劑，一般情況下選擇6-8mo1/L的濃度，蛋白質(zhì)濃度在1-10mg/mL。
在溶解色氨酸合成酶A的過程，發(fā)現(xiàn)陽離子的溶解能力順序是Gdm+ > Li+ > K+ > Na+，陰離子的順序是SCN- > I- > Br- >Cr-。一些離液劑由于它們的溶液比鹽酸胍和尿素有更高的密度和黏度而不適合用于溶解包涵體，因為利用離心和色譜分離起來比較困難。
為了溶解包涵體蛋白質(zhì)需要的尿素或者鹽酸胍的濃度根據(jù)蛋白質(zhì)的不同而不同。如果蛋白質(zhì)天然形態(tài)需要溶解的變性劑的濃度不能獲得，則在溶解包涵體時需要首先確定離液劑的濃度。
包涵體
（3）混合溶劑
一般情況下去垢劑并不聯(lián)合使用，Lilly等人發(fā)現(xiàn)去垢劑和尿素的混合液有效的摩爾濃度較低。尿素和去垢劑型的鹽混合可以使蛋白質(zhì)變性，但是尿素和非去垢劑的鹽如氯化鈉反而降低包涵體蛋白質(zhì)的溶解性，所以要避免使用。
高壓（1-2kbar）、超聲也可以溶解包涵體蛋白質(zhì)，此時使用的溶解試劑濃度可以比較低，便于后續(xù)的復性步驟。
3. 極端pH
包涵體
高pH（≥12）也被用來溶解生長激素和原胰島素。在高pH下一些蛋白質(zhì)同樣可能發(fā)生非可逆的變性，原因在于半胱氨酸在堿性條件下的脫硫過程。所以這種方法盡管比較簡單、廉價，同樣僅僅用于一些特定的蛋白質(zhì)，特別對于藥用蛋白質(zhì)一般不采用這種方法。
包涵體與蛋白質(zhì)
1. 真核細胞表達外源蛋白質(zhì)的缺點
包涵體
（1）真核細胞的天然蛋白質(zhì)的表達和外源蛋白質(zhì)的表達，表達量相當少，即使有的蛋白質(zhì)表達量高時，容易出現(xiàn)蛋白質(zhì)的無活性的現(xiàn)象，或者形成聚集體；而原核細胞表達的蛋白質(zhì)量比真核細胞大很多；
（2）相對于大腸桿菌，人類對于真核細胞的基因的了解還是有限的，而對大腸桿菌的基因了解的相當透徹，并能進行熟練的基因重組等操作對大腸桿菌的基因進行改造；
（3）真核細胞生長到高密度需要更長的時間（7天左右），并且細胞的最終濃度低，所以需要較大的培養(yǎng)容器，而大腸桿菌可以在幾個h以內(nèi)達到108cells/mL；
（4）動物細胞生長的培養(yǎng)液的造價較高，并且大部分使用血清作為生長液的添加劑，從而提高了產(chǎn)品的造價并且不利于以后的純化步驟；
包涵體
基于以上的原因，真核細胞尤其是哺乳動物細胞表達外源蛋白質(zhì)大部分處在研究階段，大部分重組蛋白質(zhì)使用的表達載體是大腸桿菌細胞。大腸桿菌表達的外源蛋白質(zhì)量相當大，有時達到細胞內(nèi)蛋白質(zhì)總量的5-20%，甚至達到50%以上。但是，大腸桿菌表達的蛋白質(zhì)，當含量相當大時，有時由于原核細胞缺少分泌到胞外的機制或者折疊的機制，最后表達的蛋白質(zhì)往往以無活性的包涵體的形式存在。
2. 包涵體表達蛋白質(zhì)的優(yōu)越性
為了研究基因的功能，可以把體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移到其他表達宿主中，研究基因表達性狀以確定基因的功能。但是，外源基因的表達，特別是真核生物基因在大腸桿菌中的表達，由于宿主菌缺乏此種基因表達的調(diào)控機制，細胞內(nèi)的化學環(huán)境與其天然環(huán)境差異，如氧化還原環(huán)境、胞內(nèi)pH、自由水的濃度，以及外源基因的導入，使得表達目的蛋白質(zhì)的細胞在非正常狀態(tài)下生長，表達的蛋白質(zhì)多數(shù)以無活性的包涵體的形式存在。
在下游生產(chǎn)過程中特別是在醫(yī)藥生產(chǎn)中，以包涵體形式表達的蛋白質(zhì)具有一些優(yōu)越性。
（1）異源表達的蛋白質(zhì)很容易被宿主細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)酶降解，如果重組蛋白質(zhì)以包涵體形式表達，由于包埋了酶攻擊的位點，可以最大限度地抵抗蛋白質(zhì)酶的攻擊；
（2）包涵體表達的蛋白質(zhì)沒有活性，細胞破碎和以后的純化步驟不用考慮蛋白質(zhì)的失活問題；
（3）包涵體形式表達的蛋白質(zhì)與宿主細胞的其他蛋白質(zhì)的分離比可溶蛋白質(zhì)的分離方法簡便，造價低，使用簡單的離心或者過濾的手段就能使包涵體與宿主細胞的其他蛋白質(zhì)成分進行有效的分離；
（4）有些表達的外源蛋白質(zhì)對細胞有毒性或者致死，大量表達時會導致細胞的死亡，最終的細胞數(shù)量和產(chǎn)物相當?shù)停欢w形式的蛋白質(zhì)由于喪失了生物活性從而可以高效大量地表達；
（5）對于以包涵體形式表達的產(chǎn)物可以比較容易進行在線觀測定性，含有包涵體蛋白質(zhì)的細胞有較大的折射率，不必像可溶的蛋白質(zhì)需要細胞破碎后使用酶學或者電泳學的方法進行鑒定。
包涵體
參考文獻
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