吸光光度分析（吸光光度分析）

定律簡介

全自動生化分析儀檢驗(yàn)血液中各物質(zhì)含量的分析是吸光光度分析方法的應(yīng)用之一，根據(jù)分析化學(xué)中的顯色反應(yīng)，利用不同的生化試劑把不同物質(zhì)的含量通過顏色深淺反應(yīng)出來，再由郎伯-比爾定律定量分析其濃度。

原理介紹

布格（Bouguer）和郎伯（Lambert）先后在1729年和1760年闡明輻射強(qiáng)度和吸收層厚度的關(guān)系，1852年比爾（Beer）又提出輻射強(qiáng)度和吸收物濃度也具有類似的關(guān)系，這便是著名的布格-郎伯-比爾定律。比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

A= = bc (2-1)

式中，A為吸光度，I0為入射輻射強(qiáng)度，It為透過輻射強(qiáng)度，b為吸收層厚度（cm），C為吸收物的摩爾濃度（M），ε為摩爾吸光系數(shù)（L﹒mol﹒cm）。此定律廣泛應(yīng)用于紫外-可見-紅外光譜區(qū)吸收測量，全自動生化分析儀中各項(xiàng)生化指標(biāo)的檢驗(yàn)也依據(jù)于此定律。

比爾定律的成立是以下列條件為前提的：

入射輻射為單色輻射；吸收過程中各物質(zhì)無相互作用，但各物質(zhì)的吸光度具有加合性；輻射與物質(zhì)的作用僅限于吸收過程，沒有熒光、散射和光化學(xué)現(xiàn)象；吸收物是一種均勻分布的連續(xù)體系。

如偏離以上任意一點(diǎn)，吸光度與濃度（或吸收層厚度）的線性關(guān)系將受影響，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。其中（2）、（3）由生化分析試劑的特性來保證，（1）由光學(xué)系統(tǒng)來保證，（4）由攪拌機(jī)構(gòu)來保證。

誤差來源

熒光和光化學(xué)反應(yīng)的影響

通常的生化試劑的熒光效率很低，產(chǎn)生的熒光又是各向同性的，只有非常少的一部分沿透射方向進(jìn)入檢測器，所以熒光的影響是可以忽略的。

采用后分光技術(shù)時(shí)，即復(fù)色光先照射比色池再進(jìn)入單色器，由于樣品所受的光輻射比較強(qiáng)，有可能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，因此，一方面要盡量減弱入射光的強(qiáng)度，另一方面要選擇不容易發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)的檢驗(yàn)試劑。

反射和散射效應(yīng)的影響

比爾定律成立的前提條件是吸收物是一種均勻分布的連續(xù)體系，如果待測液體有渾濁質(zhì)點(diǎn)，當(dāng)光輻射通過時(shí)會產(chǎn)生散射效應(yīng)，它對吸光光度分析方法測量的影響表現(xiàn)為光程不確定，散射光的一部分和透射光一起進(jìn)入檢測器，導(dǎo)致比爾定律的偏離。然而，渾濁的試樣在臨床生化檢驗(yàn)中是極為常見的，甚至一些檢驗(yàn)項(xiàng)目本身就是以測量試樣濁度為基礎(chǔ)的，為了減小散射效應(yīng)的影響，可采取雙波長或三波長分光光度法。

光的非單色性帶來的誤差

比爾定律的重要假設(shè)條件之一是入射光為單色光，但是，即使是現(xiàn)代高精度分光光度計(jì)，也不可能獲得純單色光。分光光度計(jì)單色光的純度主要取決于色散元件和光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)。大多數(shù)分光光度計(jì)只能獲得近似于單色的狹窄通光帶，它仍然具有復(fù)色光的性質(zhì)，而復(fù)色光可導(dǎo)致比爾定律的正或負(fù)向偏離。

儀器的組成

光源（電源）系統(tǒng)：光輻射與I的4次方成正比

恒溫系統(tǒng)：37

單色器：濾光片、光譜儀

比色池：流動、分立

探測器：光電池、光電倍增管

放大器：高輸入阻抗、低噪聲、電流-電壓變換

數(shù)據(jù)采集：A/D精度要求，3ABS=1/1000；3ABS-2.999ABS=18位A/D；1ABS-0.999ABS=12位A/D

分析軟件：醫(yī)學(xué)相關(guān)