分子生物學(xué)技術(shù)（研究動(dòng)植物的一種技術(shù)）

分類

目前，常用的分子生物學(xué)技術(shù)有如下幾種：

PCR

PCR- 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR- single strand conformation analysis,PCR- SSCP) 是近年來在基因突變檢測中運(yùn)用最廣泛的方法之一。PCR- SSCP 技術(shù)憑借突變可引起單鏈DNA三級構(gòu)象改變，通過觀察單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率漂移來判斷突變。樣品經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，其產(chǎn)物經(jīng)變性后可以產(chǎn)生2 條單鏈，如果存在基因突變，哪怕是一個(gè)堿基的異常，單鏈的構(gòu)象也會發(fā)生變化，正常與突變的DNA單鏈在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 中，可以顯現(xiàn)出不同的帶型，從而確定野生型和突變型，PCR- SSCP 分析的主要優(yōu)點(diǎn)是簡易且敏感性較高。但是該技術(shù)不能確定突變的部位和性質(zhì)。PCR- SSCP 突變檢測敏感性隨PCR 產(chǎn)物長度的增加而降低，一般用于檢測較小外顯子的突變。有時(shí)由于單個(gè)核苷酸變化所引起的構(gòu)象改變很小，用PAGE 電泳就可能無法檢出，在PCR 產(chǎn)物或待測DNA 小于200 bp 時(shí)，PCR- SSCP 分析能夠檢測出70%~ 95%的突變。如果以毛細(xì)管電泳代替PAGE，則可大為提高突變檢測的效率。

Wallace1997 年提出將PCR- SSCP 和異源DNA雙鏈分析（heteroduplex analysis,HA) 相結(jié)合，稱之為SSCP/ HA，部分PCR 產(chǎn)物經(jīng)變性進(jìn)行SSCP 分析以了解是否具有突變，其余PCR 產(chǎn)物直接用于電泳，以檢出含有突變的異源DNA雙鏈，電泳凝膠經(jīng)銀染，單鏈DNA所形成的帶為橘黃或棕色，而雙鏈DNA則表現(xiàn)為灰黑色。該綜合手段可以單鏈構(gòu)型多態(tài)性和異源雙鏈構(gòu)型分析兩個(gè)不同的層次檢出突變，是一種經(jīng)濟(jì)、迅速的突變檢測手段，但無法提供突變位置的信息。

PCR- SSCP 有許多改進(jìn)技術(shù)，如RNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性法（PCR- rSSCP）、雙脫氧測序單鏈片段構(gòu)象多態(tài)分析（PCR- ddF）、限制酶指紋技術(shù)(PCR- REF) 等。PCR- rSSCP 法依據(jù)RNA構(gòu)象對單個(gè)堿基替代更敏感的原理，在PCR 引物上加上某類啟動(dòng)子，通過轉(zhuǎn)錄的RNA構(gòu)象體的電泳遷移差異進(jìn)行突變鑒別。PCR- ddF 法把PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄，將轉(zhuǎn)錄物用反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行Sanger 雙脫氧終止測序反應(yīng)，通過觀察非變性膠上經(jīng)解鏈處理所產(chǎn)生的單鏈漂移、突變后終止片段的獲得與缺失來判斷突變。PCR- REF 法將RFLP 和SSCP 技術(shù)優(yōu)勢組合，將PCR 擴(kuò)增的待測片段用5~ 6 種限制酶依次消化，混合并進(jìn)行末端標(biāo)記，最后經(jīng)變性處理并在非變性凝膠上電泳分離，從而獲得來自片段長度和片段構(gòu)象的雙重突變信息。

變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 利用由堿基序列所決定的DNA片段溶解度或變性度的差異，達(dá)到分離野生型與突變型DNA片段的目的，該手段分辨率達(dá)一個(gè)堿基。當(dāng)DNA 雙鏈沿變性劑濃度梯度增加的聚丙烯酰胺凝膠遷移時(shí)，DNA分子中解鏈溫度（Tm) 低的部分逐漸變性解鏈。一般總是錯(cuò)配堿基部分的異源雙鏈Tm最低，最容易解鏈，其次是富含AT 堿基對的部位，富含GC堿基對的部位Tm值較高所以解鏈較難。因此，正常DNA雙鏈和異源雙鏈在梯度變性膠中電泳時(shí)，異源雙鏈總是先解鏈。將PCR 產(chǎn)生的雙鏈DNA在濃度遞增的尿素和甲酰胺變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，當(dāng)某一DNA片段遷移到變性劑濃度與其最低Tm相當(dāng)?shù)奈恢脮r(shí)，該片段低溫解鏈部分的雙鏈打開，部分解鏈導(dǎo)致DNA遷移速度明顯下降，觀察樣品的遷移率變化即可判斷是否存在變異。DGGE 敏感性高，即便異源雙鏈中僅含一個(gè)錯(cuò)配堿基，在電泳時(shí)也可分辨其遷移率的改變。DGGE 方法的單堿基突變檢出率在DNA片段長度600 bp 以內(nèi)可以達(dá)到95%。

DGGE 的成功有賴于雙鏈DNA內(nèi)部低溫解鏈部分變性后遷移率的改變。但在相當(dāng)于最高Tm的變性劑濃度的位置，相應(yīng)的DNA片段可能全部解鏈，使試驗(yàn)無法檢出存在于高Tm DNA片段中的堿基替換。為了解決此問題，可以在一個(gè)PCR 引物的5 ' 端設(shè)計(jì)一段富含GC的尾巴，從而使PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的一端富含GC 堿基對，保證了絕大多數(shù)DNA片段不會發(fā)生完全解鏈，在最高變性劑濃度區(qū)域仍然可以分辨出部分解鏈的異源雙鏈，這一改進(jìn)使DGGE 的突變檢出率接近100%，但DGGE 只能檢測突變是否存在而不能確定突變的位置。

DGGE 方法需要設(shè)計(jì)特定片段最佳的PCR引物以及最佳變性條件，這一過程比較復(fù)雜，梯度變性膠的制備需要的設(shè)備較昂貴，所以在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室不易實(shí)施。

雙鏈構(gòu)象多態(tài)分析法

雙鏈構(gòu)象多態(tài)分析（double- strand conformation analysis,DSCA) 是利用熒光標(biāo)記引物，通過PCR 擴(kuò)增出相關(guān)的研究片段作為熒光標(biāo)記參照（fluorescence labeled reference,FLR)DNA分子。然后，用標(biāo)記參照物FLR 分子與待測PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行雜交。因?yàn)镕LR 和樣本核苷酸序列相似，雜交反應(yīng)液中所有DNA的正鏈和反義鏈之間將形成雙鏈結(jié)構(gòu)。只有與帶熒光標(biāo)記的FLR 分子正鏈匹配的DNA雙鏈，經(jīng)過電泳后方可被DNA測序儀的激光檢測系統(tǒng)所檢測。所以，可檢雙鏈均有一樣的FLR 正鏈，雜交雙鏈的電泳遷移率可能相同，但是由于反義單鏈的差異雙鏈變性程度的差異而最終造成電泳遷移率的不同。不像SSCP 技術(shù)，DSCA能夠任意操縱變性雙鏈的形成，選用不同的FLR可以達(dá)到難分樣本的最佳分離效果。另外，通過調(diào)整FLR 和樣本待測DNA分子的比例，可專一性增強(qiáng)雜交異質(zhì)雙鏈信號并減弱純合雙鏈信號。DSCA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)還在于它依據(jù)樣品經(jīng)過固定檢測儀的時(shí)間差，而非相同電泳時(shí)間遷移的距離差來判斷突變的有無，這樣就避免了諸如SSCP 等技術(shù)分析中因遷移速率差異而降低的泳動(dòng)速度慢的條帶檢測率。另一方面，DSCA的有效檢測片段長度可達(dá)1 kb。由于激光系統(tǒng)的介入，DSCA的靈敏度和上樣量分別得以提高和降低，不到1 秒的泳動(dòng)差異也足以檢測。該技術(shù)已被成功地用于囊性纖維化基因（cystic fibrosis gene) 的4 種突變，以及HLA ?型基因中131 種等應(yīng)基因的檢測。

變性-

變性- 高壓液相色譜(denaturing high- performance liquid chromatography,DHPLC) 是利用DNA構(gòu)型改變檢測基因突變和遺傳多態(tài)性的方法之一，其可以檢測單核苷酸多態(tài)和可遺傳的突變。實(shí)驗(yàn)主要過程包括PCR 擴(kuò)增待測和正常DNA樣品，將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后再復(fù)性，若存在突變，在這一復(fù)性過程中可形成異源雙鏈。在部分變性條件下，高壓液相色譜分析可以有效地區(qū)分由變異堿基與正常堿基形成的異源DNA雙鏈和正常DNA雙鏈。由于DHPLC 的分辨率可達(dá)到1bp/ kb，而且操作過程可以全部程序化、大規(guī)模化和自動(dòng)化，使得實(shí)驗(yàn)時(shí)間大大縮短，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確率提高，可作為大群體任何基因突變初篩的有力手段，比SSCP 有更多的優(yōu)越性，具有廣泛的應(yīng)用前景，許多工作都已經(jīng)證實(shí)了DHPLC的敏感性、有效性和準(zhǔn)確性。

特異性等位基因擴(kuò)增

等位基因特異性擴(kuò)增法（allele- specific amplificarion,ASA) 是基于PCR技術(shù)的一種單核苷酸突變檢測法，是分析已知堿基替代或微小片段缺失和插入型突變的常規(guī)技術(shù)。在PCR 的引物設(shè)計(jì)中，根據(jù)已知突變位點(diǎn)性質(zhì)在引物3 ' 端或中間設(shè)計(jì)一錯(cuò)配堿基，使之僅能與突變型或野生型基因互補(bǔ)而只擴(kuò)增突變型或野生型基因。

ASA技術(shù)只需一步PCR反應(yīng)，甚至無需電泳和標(biāo)記技術(shù)。因其快速，重復(fù)性強(qiáng)，耗資少，無同位素污染以及高效性等特點(diǎn)，將成為有前途的適應(yīng)于人群大規(guī)模突變篩查的方法。應(yīng)用該方法最好避免錯(cuò)配堿基為G: T，這種錯(cuò)配可能引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)。

化學(xué)裂解錯(cuò)配堿基法

化學(xué)裂解錯(cuò)配堿基法（chemical cleavage mismatch,CCM) 通過化學(xué)修飾并切割異源DNA雙鏈中錯(cuò)配堿基，達(dá)到檢測點(diǎn)突變的目的。其原理是末端標(biāo)記的DNA片段暴露于可以識別并修飾異源雙鏈中錯(cuò)配堿基的化學(xué)試劑中（如錯(cuò)配的胞嘧啶可被羥胺修飾，錯(cuò)配的胸腺嘧啶可被四氧化鋨修飾），被修飾的位點(diǎn)隨即可被雜氮環(huán)已烷等化學(xué)物質(zhì)裂解。DNA修飾裂解后，電泳觀察DNA片段長度即可知道突變是否存在。該技術(shù)較其他突變檢測系統(tǒng)有更多的優(yōu)越性，可以掃描1~ 2 kb 的大片段DNA并在隨后的順序分析中定位突變位點(diǎn)，其效率可達(dá)100%。該手段通常首先對目標(biāo)DNA和野生型DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后對野生型DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行末端標(biāo)記，標(biāo)記片段作為探針與目標(biāo)序列復(fù)性形成異源雙鏈，用四氧化鋨（OsO4）或羥胺（hydroxylamine) 修飾并用哌啶（piperidine) 切割，聚丙烯酰胺電泳分離不同長度的片段。近年來，有人采用碳化二亞胺作為錯(cuò)配修飾劑，進(jìn)一步提高了該方法的敏感性。CCM方法最初采用同位素DNA片段，用熒光標(biāo)記代替同位素后，稱之為熒光化學(xué)裂解錯(cuò)配堿基法（FCCM），該方法依然比較敏感并且安全，可檢出95%~ 100%的錯(cuò)配?；瘜W(xué)裂解錯(cuò)配堿基法的不足之處在于工作量大，需要使用有害化學(xué)物質(zhì)作為試驗(yàn)用試劑。

應(yīng)用

分子生物學(xué)技術(shù)：可應(yīng)用于遺傳性疾病的研究和病原體的檢測及腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)、診斷和治療等方面的研究提高到了基因分子水平。

生物學(xué)定義：生物學(xué)是研究生命現(xiàn)象和生物活動(dòng)規(guī)律的科學(xué)。

據(jù)研究對象分為動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、古生物學(xué)等；依研究內(nèi)容，分為分類學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、生態(tài)學(xué)等；從方法論分為實(shí)驗(yàn)生物學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)等體系。