絕對計數(shù)（按實際檢測結果計數(shù)的方法）

概念

傳統(tǒng)的CD4陽性淋巴細胞的檢測方法是通過計數(shù)外周血總白細胞和淋巴細胞百分比來計算T淋巴細胞亞群的絕對數(shù)。這一方法需用手工或血細胞計數(shù)儀來計數(shù)總白細胞(W BC)和各分類白細胞，再用流式細胞儀或顯微鏡得出淋巴細胞亞群百分比，相乘得出 CD4T淋巴細胞的絕對數(shù)。這種雙平臺方法由于多步驟測定方法，得到的結果誤差很大，一定程度上限制了其臨床應用。

FACSCount系統(tǒng)是BD公司最近研發(fā)的一個是專門設計用來自動計數(shù) CD3 ，CD3 CD4 (CD4 )，CD3 CD8 (CD8 )陽性細胞及 CD4 /CD8 比值的集成細胞計數(shù)儀，樣本標記步驟簡捷，可以直接測量T細胞各亞群細胞的絕對數(shù)量而無須計數(shù)外周血白細胞和淋巴細胞百分比。相關研究選用另一種單平臺計數(shù)淋巴細胞各亞群的方法，以FACS M ultiSET系統(tǒng)作為參照系統(tǒng)來比較兩個系統(tǒng)得到數(shù)據(jù)的精確性、重復性以及操作特點等，評價使用 FACSCount系統(tǒng)臨床應用的可行性。

計數(shù)與分析

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）是一種B細胞的惡性腫瘤，中老年人常見，以骨髓中積聚大量的惡性漿細胞并分泌單克隆免疫球蛋白為特征。骨髓瘤的臨床表現(xiàn)較復雜，而且影響預后的因素也很多，生存期從數(shù)月到數(shù)十年不等。傳統(tǒng)的預后指標包括年齡、漿細胞指數(shù)、β2-微球蛋白（β2-MG）、分子細胞遺傳學等。有文獻報道外周血淋巴細胞絕對計數(shù)（absolute lymphocyte count，ALC）也成為惡性血液病的預后因素之一。

同時有研究證實初發(fā)時ALC較低的彌漫性大B細胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤患者的生存期較短，預后較差，但是國內(nèi)外關于ALC與MM預后的相關性研究較少。因此對102例初發(fā)的MM患者進行回顧性分析，分析ALC與患者各項臨床特征和其他預后因素的相關性，推測ALC作為MM預后指標的可行性及臨床應用價值。

（1）方法

回顧性分析了102例骨髓瘤患者，查閱并記錄患者年齡、性別、ALC、乳酸脫氫酶（LDH）、白蛋白（ALB）、β2-MG、肌酐（Cr）及其總生存期（overall sur?vival，OS）以相應ALC的中位數(shù)分組，后統(tǒng)計ALC與

其他各項臨床指標的相關性。隨訪截止日期為2012年2月29日?？偵鏁r間的計算為疾病確診時間至死亡或末次隨訪的時間段。所有失訪患者均計算至末次隨訪日止，按截尾數(shù)據(jù)處理。隨訪方法采用電話隨訪。

（2）統(tǒng)計分析

采用SPSS10.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。組間計數(shù)資料采用χ 檢驗，計量資料采用t檢驗。對生存概率的估計采用Kaplan-Meier法，并用Log-rank法對結果進行顯著性檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

機體的免疫狀態(tài)和惡性血液病的轉(zhuǎn)歸與預后有很大關系，ALC代表患者的免疫狀態(tài)，也是影響其預后的因素之一。有文獻報道ALC不僅可預測非霍奇金淋巴瘤預后，對霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、急性白血病、卵巢癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、進展期軟組織肉瘤等也具有預后價值。ALC減少與不良預后之間的關系機制尚不清楚，可能與ALC減少與機體免疫抑制相關，反映機體免疫功能低下；淋巴瘤細胞分泌的細胞因子對淋巴細胞具有毒性溶解作用，導致ALC減少。上述兩種因素共同存在，也可能存在其他未知因素。Brown等的研究發(fā)現(xiàn)，MM患者體內(nèi)有

著免疫系統(tǒng)的多種缺陷，而且免疫功能的缺陷作為該病的一個重要特征影響著疾病的進程，只是具體免疫功能缺陷的分子機制尚不明確。

有研究報道，淋巴瘤患者自體造血干細胞移植后ALC>0.5×10 /L的患者中位OS及疾病無進展生存率（PFS）明顯高于ALC<0.5×10 /L的患者。Ege等發(fā)現(xiàn)MM患者ALC<1.4×10 /L，OS較短。本研究發(fā)現(xiàn)初發(fā)時ALC>1.51× 10 /L 的患者中位OS明顯高于ALC<1.51×10 /L的患者，與文獻基本一致。說明ALC對MM預后的判斷有一定的幫助性。

Bradwell等研究證實血清游離輕鏈和β2-MG與MM預后相關。同時有文獻報道血清LDH越高，腫瘤惡性程度越高，預后也越差。Palumbo等研究發(fā)現(xiàn)，患者的年齡對于個性化治療有重要影響，患者年齡>75歲是其預后不良的影響因素之一，年齡越大，預后越差。Barlogie等的研究發(fā)現(xiàn)高LDH和血鈣水平等指標影響了MM患者的早期生存，而年齡和β2-MG可影響長期生存。還有文獻顯示LDH水平是MM的一項獨立預后指標，可以作為評估疾病進

展及預后狀態(tài)的重要指標。本組實驗的統(tǒng)計結果顯示，初發(fā)時高水平 ALC 的 MM 患者發(fā)病年齡、血清LDH及β2-MG均低于低水平 ALC的患者，由此可以推測 ALC 與其他預后指標結合，對于患者的預后有重要意義。

近年來預測 MM的預后變得更加復雜，與之有關的預后因素的研究也不斷涌現(xiàn)。本研究通過分析ALC與患者各項臨床指標和總生存期的相關性，ALC較高的患者發(fā)病年齡較低，血清LDH值及β2-MG較低，同時總生存期較長。因此可以推測ALC可作為MM獨立的預后因素之一。ALC檢測簡潔方便，費用低，對患者的負擔小，便于普及使用于任何類型的醫(yī)療機構。同時耗時較短，可以及時為臨床醫(yī)生提供第一手的信息，方便及早干預治療。由于本研究樣本例數(shù)有限，未對患者的分子細胞遺傳學改變進行隨訪，因此未找到 ALC與分子細胞遺傳學的相關性，

有待增加樣本加強隨訪，進一步分析。

方法

干細胞移植對于白血病等多種疾病的治療具有重要意義，而準確的干細胞絕對計數(shù)對于干細胞移植的成敗又十分重要。流式細胞儀結合熒光單抗技術為干細胞絕對計數(shù)提供了一種快速、定量、重復性好的方法。

干細胞計數(shù)是根據(jù)血液中不同血細胞的特性，選擇特異性標記物，采用多參數(shù)分析的方法，排除細胞之間的干擾，識別出不同的細胞并分類計數(shù)。具體而言，針對干細胞核酸含量高、大小與大淋巴細胞相近、粒度與淋巴細胞相似、CD45 表達弱、CD34 表達強的特點，首先可通過核酸染料標記所有的有核細胞(包括白細胞和幼稚的紅細胞)，排除細胞碎片及無核細胞；其次通過抗CD45抗體標記所有白細胞，并根據(jù)CD45表達強度的不同區(qū)分不同的白細胞，從而排除CD45表達強的細胞，避免CD45弱表達細胞的丟失；然后用抗CD34抗體標記CD34陽性表達的細胞，即干細胞?？傊ㄟ^核酸量、SSC的強度、CD45和CD34的表達量等多個參數(shù)將干細胞與淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、死細胞、細胞碎片、血小板團塊以及紅細胞區(qū)別開來。

同時，樣品管中還加有已知數(shù)量的三色標記的易于與細胞區(qū)分的熒光微球作為絕對計數(shù)的內(nèi)標。根據(jù)所采集到的干細胞數(shù)與熒光微球數(shù)目的比值，再乘以樣品管中的熒光微球數(shù)，即為樣品管中干細胞的數(shù)目，再除以樣品的體積，即可求得樣品中干細胞的濃度。

對于有劑量要求的干細胞移植方案而言，精確的干細胞計數(shù)顯然十分重要。研究表明，需要輸入病人體內(nèi)的 CD34陽性細胞量取決于病人的體重，每公斤體重應輸入2百萬至5百萬個CD34陽性細胞。此重要性也顯示在動員及白細胞分離過程中，如通過計數(shù)細胞水平判斷動員是否成功、何時為最佳采集時間以及采集到的干細胞數(shù)量是否足夠等等。由于干細胞所占的比例很小，在外周血中不到0.1%，在骨髓中也只占單個核細胞的1%至4%，因此利用流式細胞儀在大量細胞中快速準確地篩選并測出干細胞的絕對數(shù)量對于干細胞移植具有重要意義。