雙脫氧（確定核酸中核苷酸序列的方法）

雙脫氧測(cè)序

雙脫氧

1980年桑格因設(shè)計(jì)出這種測(cè)定DNA(脫氧核糖核酸)內(nèi)核苷酸排列順序的方法而與W·吉爾伯特、P·伯格共獲1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

通常DNA的復(fù)制需要：DNA聚合酶，單鏈DNA模板，帶有3'-OH末端的單鏈寡核苷酸引物，4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指導(dǎo)，不斷地將dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互補(bǔ)DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸，雙　脫氧核苷三磷酸（ddNTP），因?yàn)樗c普通dNTP不同，在脫氧核糖的3’位置缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。例如，存在ddCTP、dCTP和三種其他的dNTP（其中一種為α-32P標(biāo)記）的情況下，將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫，即可形成一種全部具有相同的5'-引物端和以ddC殘基為3’端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區(qū)帶圖譜將為新合成的不同長度的DNA鏈中C的分布提供準(zhǔn)確信息，從而將全部C的位置確定下來。采用類似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下，可同時(shí)制得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3'端結(jié)尾的三組長短不一的片段。將制得的四組混合物全部平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個(gè)組分將按其鏈長的不同得到分離，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列。

簡介

現(xiàn)行的邏終止法人加減法序列測(cè)定技術(shù)（Sacger和Coulson，1975）發(fā)展而來的。加減法首次引入了使用特異引物在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)、堿基特異性的鏈終止，以及采用聚丙烯酰胺凝膠區(qū)分長度差一個(gè)核苷酸的單鏈DAN等3種方法。盡管有了這些進(jìn)展，但加減法仍然太不精確，也太不得法，因此難以廣為接受。直至引入雙氧核苷三磷酸（ddTBP）作為鏈終止劑（Sanger等，1977 ），酶法DNA序列測(cè)定技術(shù)才得到廣泛應(yīng)用。2'，3'ddNTP與普通dNTP不同之處在同它們?cè)诿撗鹾颂堑?' 位置缺少一個(gè)羥基。它們可以在DNA聚合酶作用下通過其5' 三磷酸基團(tuán)摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于沒有3'羥基，它們不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鏈，因此，正在增長的DNA鏈不可能繼續(xù)延伸。這樣，在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開競(jìng)爭，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離。在4組獨(dú)立的酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的每一個(gè)A、每一個(gè)G或每一個(gè)T的位置上。

Sanger法的試劑

酶促測(cè)序反應(yīng)中利用一個(gè)與模板鏈特定序列互補(bǔ)的合成寡核苷酸作為DNA合成的引物。在許多情況下，可將靶DNA片段克隆于M13噬菌體或噬菌粒載體，以取得單鏈DNA分子作為模板。但也可以采用Sanger 法商定變性雙鏈DNA模板的序列。在以上兩種情況下，可以采用能與位于靶DNA側(cè)翼的載體序列相退火的通用引物，而不必取得與未知DNA序列互補(bǔ)的引物。適M13噬菌體重組克隆的通用測(cè)序引物一般長15-29 個(gè)核苷酸，并可與緊靠M13mp18噬菌體多克隆位點(diǎn)區(qū)的HindⅢ位點(diǎn)成M13mp19 噬菌體多克隆位點(diǎn)區(qū)的EcoRI位點(diǎn)的序列互補(bǔ)。這些引物同樣也可用于對(duì)克隆于pUC質(zhì)粒的DNA進(jìn)行“雙鏈”測(cè)序，并可從許多廠商中購置得到。此外，還有若干家公司出售一些引物，這些引物下為了對(duì)通過多種限制酶切位點(diǎn)克隆于不同質(zhì)粒的靶DNA進(jìn)行測(cè)序而設(shè)計(jì)的。

如上所述，有兩類DNA可以用作Sanger 法測(cè)序的模板：純單鏈DNA和經(jīng)過熱變性或堿變性的雙鏈DNA。采用通常從重組M13噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA應(yīng)中獲得數(shù)百個(gè)核苷酸的序列。如用變性雙鏈DNA作模板，則較難獲得這一質(zhì)量的結(jié)果，盡管采用雙鏈DNA模板的方法顯然既簡單又方便（Chen和Seeburg，1985）。

然而只是在不久前得到改進(jìn)以后，這一方法才發(fā)展到能夠獲得明確可信結(jié)果的水平。其中有兩個(gè)因素是至關(guān)重要的，這就是模板DNA的質(zhì)量和所用DNA聚合酶的種類。小量制箅的質(zhì)粒DNA常常被寡脫氧核糖核苷酸小分子、核糖苷酸及DNA聚合酶的抑制劑所污染，其中前兩種污染物可被用作隨機(jī)引物。結(jié)果，種種“鬼”帶、強(qiáng)終止現(xiàn)象，以及其他假象往往使測(cè)序凝膠含混不清、黯然失色。因此采用小量制備的質(zhì)粒NDA來測(cè)定未知DNA克隆片段的序列，并不可取。然而，這類DNA?？勺鳛閷?duì)已經(jīng)通過另一方法測(cè)定的序列進(jìn)行進(jìn)一步的合適模板。采用CsCl－溴化乙錠梯度平衡離心法來純化質(zhì)粒DNA，測(cè)序的結(jié)果會(huì)好得多，但卻要耗費(fèi)大量的人務(wù)和物力。模板鏈的每一個(gè)A、每一個(gè)G或每一個(gè)T的位置上。

DNA聚合酶

這種酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然廣泛用于DNA序列測(cè)定的酶。通常碰到的兩個(gè)問題是：

1）Koenow片段的持續(xù)合成能力低，以致一些片段并非由于dd NTP的摻入，而是因?yàn)榫酆纤崛四０迳想S機(jī)解離而終止合成，因而導(dǎo)致背景增高。由于該酶不能沿模板進(jìn)行長中距離移動(dòng)，因此利用該酶進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序反應(yīng)所得序列的長度有限。通常，這一反應(yīng)只能得到大約250-350個(gè)核苷酸的序列。如果分兩步進(jìn)行反應(yīng)，所得序列的數(shù)目可以翻一番；其中第一步是初始標(biāo)記步驟，采用低濃度的dNTP，而隨后的第二步是鏈延伸－鏈終止反應(yīng)，含有ddNTP和高濃度的dNTP（Johoston-Dow等，1987;Stambaugh和Blakesley，1988）。然而即使有了這些改進(jìn)，用Klenow 酶所測(cè)序列的長度通常還是不如持續(xù)合成能力較強(qiáng)的測(cè)序酶。

2）這種酶對(duì)模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域進(jìn)行復(fù)制的效能很低。將聚合反應(yīng)的溫度提高到55℃，可以緩解但并不能徹底解決這一問題（Gomer和Firtel，1985)。有時(shí)可采用一些dNTP類似物[如dITP或7－脫氮dGTP（7－deaza-dGTP）]來獲取模板中可形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的相應(yīng)區(qū)段的序列信息，但Kleow酶對(duì)這些類似物的作用不如測(cè)序酶有效，這也許是因?yàn)樗鼈兪筀lenow酶原已較低的持續(xù)合成能力進(jìn)一步降低。

總而言這，可以選用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段測(cè)定從引物5'位置起250個(gè)堿基以內(nèi)的一段DNA序列，但不宜用它來測(cè)定更長一段DNA序列或者具有二重對(duì)稱和（或）同聚核苷酸段的DNA序列。

盡管日常測(cè)序工作并不廣泛使用反轉(zhuǎn)錄酶，但有時(shí)用這個(gè)酶解決一些由于模板DNA中存在A/T或G/C同聚核苷酸區(qū)而引起的問題。來自禽類和鼠類反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄酶在這一看來要比Klenow酶略勝一籌（Karanthaansis，1982;Graham等,1986

）,盡管它們也許還是比測(cè)序酶遜色（Cameron-Mills，1988;Revak等1988）。

測(cè)序酶（SequenaseTM）是一種經(jīng)過化學(xué)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶。這酶原來具有很強(qiáng)的3'→5'外切核酸活性，經(jīng)過修飾后，這一活性大部分均被消除。測(cè)序酶2.0版是測(cè)序酶的基因工程產(chǎn)品，它完全缺失了3' →5'外切核酸酶活性，極其穩(wěn)定而經(jīng)活性要比經(jīng)化學(xué)修飾的測(cè)序酶高2倍。測(cè)序酶持續(xù)合成能力很強(qiáng)，聚合速率很高，對(duì)諸如dITP和7－脫氮－dGTP等用于提高分子辨率使測(cè)序凝膠某些區(qū)段上的壓縮條帶得以分開的核苷酸類似物具有廣泛的耐受性。它是測(cè)定長段DNA序列的首選酶。測(cè)序酶可以沿模板移動(dòng)很長的距離，因而一套反應(yīng)常常就可以測(cè)定數(shù)百個(gè)核苷酸的DNA序列。實(shí)際上，測(cè)得序列的長度更多是受聚丙烯酰胺凝膠的分辨能力而不是受該聚合酶的特性所制約。為了充分利用測(cè)序酶極高的持續(xù)合成能力，可采用兩步測(cè)序反應(yīng)。第一步首先采用低濃度的dNTP的較低溫度，以便將合成反應(yīng)限制在適度之下并確保放射性標(biāo)記dNTP和較低溫度，以便將合成反應(yīng)限制在適度之下并確保放射性標(biāo)記dNTP的有效摻入，這步反應(yīng)的產(chǎn)物是僅僅延伸了20-30堿基的引物。再將第一步反應(yīng)等分于4組1套的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)系統(tǒng)中，每組反應(yīng)中都含有高濃度的dNTP和一種ddNTP。這樣聚合反應(yīng)就得以繼續(xù)，直至造成鏈終止的核革酸摻入正在增長的鏈中。

Taq DNA聚合酶適用于測(cè)定在37 ℃形成大段穩(wěn)定十級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈DNA模板序列。這是因?yàn)門aq

DNA聚合酶在70-75℃活性最高，這一溫度下即使GC豐富的模板也無法形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。按照1nnis 等（1988）介紹的方法使用Taq DNA聚合酶進(jìn)行測(cè)序，在放射自顯影片上得到的測(cè)序梯連續(xù)數(shù)百個(gè)堿基條帶始終清晰如一，表明這種酶的持續(xù)合成能力甚佳。模板鏈的每一個(gè)A、每一個(gè)G或每一個(gè)T的位置上。模板鏈的每一個(gè)A、每一個(gè)G或每一個(gè)T的位置上。

直至幾年以前，實(shí)際上所有DNA測(cè)序反應(yīng)都用[α－32P]dNTP來進(jìn)行。然而32P發(fā)射的強(qiáng)β粒子造成兩個(gè)問題。首先由于發(fā)生散射，放射自顯影片上的條帶遠(yuǎn)比凝膠上的DNA條帶更寬、更為擴(kuò)散，因此將影響到所讀取的序列（尤其是從放射自顯影片的上部所讀取的序列）的正確性并將制約從單一凝膠上能讀出的核苷酸序列的長度。其次32P的衰變會(huì)引起樣品中DNA的輻射分解，因此用32P進(jìn)行標(biāo)記的測(cè)序反應(yīng)只能保存一兩天，否則DNA將被嚴(yán)重破壞以至測(cè)序凝膠上模糊不清、真假莫辨。[35S]dATP的引入（Biggin等，1983）大大緩解了上述兩方面的矛盾。由于35S衰變產(chǎn)生較弱的β粒子，其散射有所減弱，凝膠和放射自顯影片之間在分辨率上相差無幾，因此可以從一套反應(yīng)中確切測(cè)定數(shù)百核苷酸的DNA序列。此外，35S的低能輻射所引起的樣品分解比較輕微，因此，測(cè)序反應(yīng)可在－20℃保存至1周，而分辨率不見下降。這樣，職果聚丙烯酰胺凝膠方面了發(fā)生技術(shù)故障，只要對(duì)測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行重分析即可。

dNTP類似物

測(cè)定戰(zhàn)略

由于DNA一般都由幾千個(gè)單核苷組成。而目前測(cè)定DNA序列的最好方法，一次也只能測(cè)約600個(gè)核苷酸，因此進(jìn)行DNA順序測(cè)定前，需要用不同限制酶消化等測(cè)DNA，使其降成小片段，分別克隆到pUC1,18pUCl18,pUC19,M13mp18,M13mp19等載體中，分別測(cè)定各小片段的順序，由于不同限制酶產(chǎn)生的片段之間有交錯(cuò)重疊順序，根據(jù)片段間和末端重疊序列，用計(jì)算機(jī)軟件如Mac Vector TM5.0分析DNA，Assemblylign TM排列出各片段的位置，進(jìn)而排出DNA的全序列。

測(cè)定方法

以M13噬菌體為載體的雙氧鏈終止法的實(shí)施步驟為例：

M13噬菌體復(fù)制型雙鏈DNA（RFDNA）的制備。

為了將待測(cè)雙鏈DNA進(jìn)行克隆，必須制備M13mp18或M13　mp19復(fù)制型（閉環(huán)雙鏈）DNA，從M9培養(yǎng)基中，挑起單個(gè)克隆大腸桿菌，JM101到50ml2×YT培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。稀釋1ml培養(yǎng)物到50ml2×YT培養(yǎng)中，于37℃振搖6h，轉(zhuǎn)移2ml培養(yǎng)物于微量離心管中，12000g，離心5min細(xì)菌沉淀保留用于分離復(fù)制型RFDNA，上清用于分離噬菌體單鏈DNA。

細(xì)菌沉淀用于分離復(fù)制型DNA，可以采用標(biāo)準(zhǔn)的堿解方法或采用天美公司的Wizard Miniperps DNA試劑盒制備。（方法同分離質(zhì)粒DNA方法）。

采用多克隆位點(diǎn)上的限制性內(nèi)加酶切割待測(cè)DNA，并采用相同內(nèi)切酶切割M13噬菌體RFDNA（采用Biol 101gene clean Ⅱ試劑盒分別純化內(nèi)切酶切割后的DNA片段），然后將待測(cè)外源DNA片段與M13復(fù)制型載體DNA連接過夜，連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)染JM101感受態(tài)細(xì)菌，將連接物10μl與200μl感受態(tài)細(xì)菌混勻，放置冰上40～50min，再放在42℃水浴2min，然后加入1ml新鮮的靜止相JM101培養(yǎng)物混勻，然后分別以300μl于含有IPIG（200mg/ml）和X-gal200mg/ml的2×YT培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)8h即可出現(xiàn)藍(lán)色和白色噬斑，白色或稱無菌噬斑，即為陽性重組噬菌體。

上述平板的每個(gè)白色噬菌斑是由一種重組M13DNA分子轉(zhuǎn)染細(xì)菌后產(chǎn)生的，如果取一個(gè)白色噬菌斑進(jìn)行培養(yǎng)便可得到一種單鏈形式的DNA。為此，挑取一個(gè)白色噬菌斑轉(zhuǎn)接到一個(gè)新鮮制備的OD600=0.1的大腸桿菌JM101培養(yǎng)物中，于37℃振搖5h左右，12000g離心10min，上清轉(zhuǎn)移到另一新微量離心管中用于分離單鏈DNA，按1ml上清液中加入含20%聚乙二醇PEG-6000的2.5m NaCl 200μl沉淀噬菌體，再用飽和酚抽提除去噬菌體蛋白，最后用1/10體積的3m NaAc和乙醇沉淀單鏈DNA，濃度調(diào)至0.1～0.5μg/μl，也可采用天美公司的Wizard TM M13DNA純化試劑盒分離純化M13單鏈DNA。

可以購買通用引物或?qū)嶒?yàn)室合成15bp～26bp長度的引物，通常以2μg/ml的濃度貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>微量滴板

進(jìn)行大批量的模板測(cè)序時(shí)，常在密閉的微量離心管中進(jìn)行與引物的退火反應(yīng)，然后在微量滴板中進(jìn)行鏈延伸-鏈終止反應(yīng)。

測(cè)序凝膠裝置的大小形狀均不相同，其主要參數(shù)有：①長度通常為40～50cm；②寬度通常為20cm；③厚度通常為0.3～0.4mm；④橫截面形狀為楔形或錐形，即頂部薄，底部厚，或者是將底部凝膠緩沖液的濃度提高；⑤加樣槽；⑥整塊凝膠上的溫度應(yīng)均一。

如標(biāo)題

此時(shí)讀取的是目的DNA的互補(bǔ)鏈3'～5'的序列。