納米金（氯金酸通過還原法制備出的顆粒）

發(fā)展歷史

自從16世紀(jì)歐洲現(xiàn)代化學(xué)的奠基人、杰出的醫(yī)師、化學(xué)家Paracelsus制備出“飲用金”用來治療精神類疾病以來，納米金就開始登上了科學(xué)的舞臺(tái)。1857年英國科學(xué)家法拉第在研究道爾頓的理論時(shí)，利用氯化金還原出含納米金的溶液，發(fā)現(xiàn)在其中加入少量電解質(zhì)后，可使溶液由紅寶石色變?yōu)樗{(lán)色，并最終凝集為無色，而加入明膠等大分子物質(zhì)便可阻止這種變化。盡管當(dāng)時(shí)并不知道原因，但他的發(fā)現(xiàn)為納米金的應(yīng)用奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。1885年納米金溶液在美國常作為治療酗酒的主要成分；1890年Koch醫(yī)生發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌不能夠在金的表面存活；1890年納米金被用來治療關(guān)節(jié)炎；1935年芝加哥外科專家Edward等人發(fā)現(xiàn)納米金溶液能有效的減輕患者病痛，強(qiáng)健體質(zhì)。1939年Kausche和Ruska用電子顯微鏡觀察金顆粒標(biāo)記的煙草花葉病毒，呈高電子密度細(xì)顆粒狀。1971年Faulk和Taylor首次采用免疫金染色(immunogold staining，IGS)將兔抗沙門氏菌抗血清與納米金顆粒結(jié)合，用直接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測沙門氏菌的表面抗原，開創(chuàng)了納米金免疫標(biāo)記技術(shù)。

檢測技術(shù)發(fā)展

納米金溶液

納米金

均相溶膠顆粒免疫測定法(sol particle immunoassay， SPIA)是利用免疫學(xué)反應(yīng)時(shí)

金顆粒凝聚導(dǎo)致顏色減退的原理，將納米金與抗體結(jié)合，建立微量凝集試驗(yàn)檢測相應(yīng)的抗原，如間接血凝一樣，用肉眼可直接觀察到凝集顆粒。已成功地應(yīng)用于PCG的檢測，直接應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。

應(yīng)用熒光素標(biāo)記的抗體，通過流式細(xì)胞儀(Flow CytoMeter，F(xiàn)CM)計(jì)數(shù)分析細(xì)胞表面抗原，是免疫學(xué)研究中的重要技術(shù)之一。但由于不同熒光素的光譜相互重疊，區(qū)分不同的標(biāo)記很困難。Boehmer等研究發(fā)現(xiàn)，納米金可以明顯改變紅色激光的散射角，利用納米金標(biāo)記的羊抗鼠Ig抗體應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)，分析不同類型細(xì)胞的表面抗原，結(jié)果納米金標(biāo)記的細(xì)胞在波長632nm時(shí)，90度散射角可放大10倍以上，同時(shí)不影響細(xì)胞活性。而且與熒光素共同標(biāo)記，彼此互不干擾。因此，納米金可作為多參數(shù)細(xì)胞分析和分選的有效標(biāo)記物，分析各類細(xì)胞表面標(biāo)志和細(xì)胞內(nèi)含物。

斑點(diǎn)免疫金銀染色法(Dot-IGS，IGSS)是將斑點(diǎn)ELISA與免疫納米金結(jié)合起來的一種方法。將蛋白質(zhì)抗原直接點(diǎn)樣在硝酸纖維膜上，與特異性抗體反應(yīng)后，再滴加納米金標(biāo)記的第二抗體，結(jié)果在抗原抗體反應(yīng)處發(fā)生金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn)，此稱為斑點(diǎn)免疫金染色法(Dot-IGS)。此反應(yīng)可通過銀顯影液增強(qiáng)，即斑點(diǎn)金銀染色法(Dot-IGS/IGSS)。

免疫印跡技術(shù)(immunoblotting，IBT)也稱為免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)，其原理是根據(jù)各種抗原分子量大小不同，在電泳中行走的速度不同，因而在硝酸纖維素膜上占據(jù)的位置也不同；把含有特異性抗體的血清和這一薄膜反應(yīng)，那么特異性的抗原抗體反應(yīng)就顯色。而納米金免疫印跡技術(shù)相比酶標(biāo)記免疫印跡技術(shù)具有簡單、快速、具有相當(dāng)高的靈敏度。而且應(yīng)用納米金將硝酸纖維素膜上未反應(yīng)抗體進(jìn)行染色，評估轉(zhuǎn)膜效率，校正抗原一抗體反應(yīng)的光密度曲線，即可進(jìn)行定量免疫印跡測定。

斑點(diǎn)金免疫滲濾測定法(dot immuno-gold filtration assay，DIGFA)是斑點(diǎn)免疫測定法(dot immunoboding assay，DIBA)中的一種，是1982年由Hawkes等人在免疫印跡技術(shù)基礎(chǔ)上改良發(fā)展起來的一項(xiàng)免疫學(xué)新技術(shù)。其原理完全同斑點(diǎn)免疫金染色法，只是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強(qiáng)的墊料，即為滲濾裝置。在加抗原(抗體)后，迅速加抗體(抗原)，再加金標(biāo)記第二抗體，由于有滲濾裝置，反應(yīng)很快，在數(shù)分鐘內(nèi)即可顯出顏色反應(yīng)。與斑點(diǎn)免疫滲濾測定法(d o t immunotietration assay，DIFA)相比，所不同的是免加底物液，直接由紅色膠體金探針顯色，結(jié)果鮮艷，背景更清楚，可以在室溫下保存。該方法已成功地應(yīng)用于人的免疫缺陷病病毒(HI)的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測。目前使用的有HCG試劑盒，AFP試劑盒，消化道腫瘤篩檢試劑盒。

免疫層析法(gold immunochromatography assay， GICA)是將各種反應(yīng)試劑以條帶狀固定在同一試紙條上，待檢標(biāo)本加在試紙條的一端，將一種試劑溶解后，通過毛細(xì)作用在層析條上滲濾、移行并與膜上另一種試劑接觸，樣品中的待測物同層析材料上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。層析過程中免疫復(fù)合物被截留、聚集在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶)，通過可目測的納米金標(biāo)記物得到直觀的顯色結(jié)果。而游離標(biāo)記物則越過檢測帶，達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動(dòng)分離之目的。GICA特點(diǎn)是單一試劑，一步操作，全部試劑可在室溫長期保存。這種新的方法將納米金免疫檢測試驗(yàn)推進(jìn)到～個(gè)嶄新的階段。

生物傳感器(biosensor)是指能感應(yīng)(或響應(yīng))生物、化學(xué)量，并按一定規(guī)律將其轉(zhuǎn)換成可用信號(hào)(包括電信號(hào)、光信號(hào)等)輸出的器件或裝置。在生物傳感器方面，納米金主要設(shè)計(jì)為免疫傳感器，是利用生物體內(nèi)抗原與抗體專一性結(jié)合而導(dǎo)致電化學(xué)變化設(shè)計(jì)而成。另外由于納米金的氧化還原電位是+1.68V，具有極強(qiáng)的奪電子能力，能大大提高作為測定血糖的生物傳感器葡萄糖氧化酶膜的活性，金顆粒越細(xì)，活性越大。

生物芯片是以膜、玻璃、硅等固相介質(zhì)為載體，其最大的優(yōu)點(diǎn)在于高通量、并行化、微型化。一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)檢測多種或多份生物樣品。生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片。目前，生物芯片用于食品安全檢測領(lǐng)域的應(yīng)用主要包括農(nóng)藥、獸藥殘留檢測，食品微生物檢測、動(dòng)物疫病監(jiān)測、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物植物檢測等。2002年P(guān)ark等在《Science》雜志上介紹了一種以納米金為探針的基于電荷檢測的新型基因芯片，該芯片具有非常好的靈敏度及特異性，可以在十萬分之一比率中檢測出單堿基突變的基因片段。

檢測中的應(yīng)用

目前食品檢測分析一般采用化學(xué)分析法(CA)、薄層層析法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)，但需要繁瑣、耗時(shí)的前處理，樣品損失也較大。相對于靈敏度較低的CA和TLC方法，GC、HPLC的靈敏度較高，但操作技術(shù)要求高、儀器昂貴，并不適合現(xiàn)場快速測定和普及，而以納米金為免疫標(biāo)記物的檢測技術(shù)正彌補(bǔ)了這些技術(shù)的缺點(diǎn)，在現(xiàn)代食品分析檢測中的運(yùn)用也越來越多。

所謂獸藥殘留是指動(dòng)物產(chǎn)品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及，或其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)的殘留。獸藥殘留既包括原藥也包括藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。主要的殘留獸藥有抗生素類、磺胺藥類、呋喃藥類、抗球蟲藥、激素藥類和驅(qū)蟲藥類。獸藥通常是通過在預(yù)防和治療動(dòng)物疾病用藥、在飼料添加劑中使用以及在食品保鮮中引入藥物而帶來對食品的污染。人長期攝入含獸藥的動(dòng)物性食品后，不但會(huì)對人體產(chǎn)生毒性作用，出現(xiàn)過敏反應(yīng)，而且動(dòng)物體內(nèi)的耐藥菌株可傳播給人體，當(dāng)人體發(fā)生疾病時(shí)，就給臨床上感染性疾病的治療帶來一定的困難，延誤正常的治療。另外有些殘留物還具有致畸、致癌、致突變作用。

Verheijen利用膠體金標(biāo)記純化的抗鏈霉素單克隆抗體，對鏈霉素的檢測限為160ng/ml，檢測方便快速，不需要其他試劑和儀器，時(shí)間僅需lOmintl41。而使用膠體金免疫層析試紙條，在檢測蝦肉等組織試樣中殘留氯霉素(chloramphenicol，CAP)殘留時(shí)，靈敏度可達(dá)到 lng/ml，只需5～10min，并且與類似物沒有交叉反應(yīng)。Yong Jin等也使用金標(biāo)法來檢測動(dòng)物血漿和牛奶中的新霉素殘留，其檢測限為10ng/mltl6J。鹽酸克倫特羅即β2受體興奮劑，俗稱“瘦肉精”能增強(qiáng)脂解和減慢蛋白質(zhì)分解代謝，若在畜牧生產(chǎn)中使用，可明顯提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率；但使用劑量過大，則會(huì)對動(dòng)物和人(間接)的肝臟、腎臟等器官產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。盡管歐盟于1996年禁止在畜牧生產(chǎn)中使用該藥(EC Direc． tive 96/22/EC)，我國農(nóng)業(yè)部也于1997年明令禁止，但國內(nèi)“瘦肉精”中毒事件時(shí)有發(fā)生。劉見使用金標(biāo)試紙法快速檢測檢測鹽酸克倫特羅，最小檢測量達(dá)到40ng/ml。現(xiàn)在商品化的試紙條產(chǎn)品現(xiàn)在也比較成熟，比利時(shí)UCB Bio-products公司開發(fā)的Tlhe Beta STAR檢測法就是將特定的β-內(nèi)酰胺受體固定在試紙條上，用膠體金有色微粒作為標(biāo)記物，5min內(nèi)可以檢測到青霉素和頭孢霉素殘留。而國內(nèi)的劉平在用生物電化學(xué)傳感器檢測牛奶中殘留的青霉素時(shí)，認(rèn)為使用納米金將有助于提高傳感器的檢測限。

動(dòng)物傳染病不但會(huì)影響動(dòng)物養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)，也對人類健康構(gòu)成威脅，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織已把預(yù)防和控制嚴(yán)重的動(dòng)物流行病作為其工作重點(diǎn)之一。蝦白斑病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是阻礙蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素，至今還沒有有效的藥物，所以及早檢測出病毒，顯得尤其重要。Wang Xiaojie等已成功研究了斑點(diǎn)免疫金滲濾法(DIGFA)t19~和金標(biāo)試紙法來檢測蝦白斑病毒，其中金標(biāo)試紙法的檢測限為1 μg/ml，而使用銀增強(qiáng)，可以達(dá)到0.01μg/ml。賴清金等使用金標(biāo)試紙條來檢測豬瘟病毒，10～15min就能檢出結(jié)果，并可根據(jù)檢測結(jié)果合理指導(dǎo)豬瘟免疫和建立適宜的免疫程序。禽流感病毒(AIV)是引起禽類急性死亡的烈性、病毒性傳染病，而且能感染人，我國許多地區(qū)也先后報(bào)道有高致病性禽流感的發(fā)生，給養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重威脅了人類的健康。劉永德等將兔抗禽流感H5、H9亞型病毒抗體純化后，分別與制備的膠體金研制成免疫金探針，用改良的滲濾法安全快速地檢測被檢材料中禽流感H5、H9亞型病毒，3min即可得到結(jié)果，檢測靈敏度分別為1.62ug/ml和1.25μg/ml。

農(nóng)藥殘留分析的困難包括：樣品基質(zhì)背景復(fù)雜、前處理過程繁瑣，需要耗費(fèi)較多的時(shí)間、被測成分濃度較低、分析儀器的定性能力受到限制、儀器檢測靈敏度不夠等一系列問題，但使用金標(biāo)記的快速檢測可以很好的解決以上問題。國內(nèi)的王朔分別使用納米金免疫層析和納米金滲濾法檢測西維因的殘留，整個(gè)檢測過程只需5min，檢測限也分別達(dá)到100ug/L和50μg/L。國內(nèi)的生物技術(shù)公司也開發(fā)出了成熟的商品化產(chǎn)品，如克百威農(nóng)殘速測試紙條等。

目前基于金標(biāo)記的快速檢測研究在致病微生物方面比較多，檢測的種類也比較多。最早Hasan以免疫磁性分離技術(shù)為基礎(chǔ)的免疫膠體金技術(shù)已成功應(yīng)用于01群霍亂弧菌(Vibriocholerae)的檢測。國內(nèi)洪幫興等人研究了以硝酸纖維膜為載體納米金顯色的寡核苷酸芯片技術(shù)，為在分子水平快速簡便的鑒別致病菌提供了可能，甚至可以檢出致病菌的耐藥性變異。該芯片技術(shù)對大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、變形桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、肉毒梭菌和空腸彎曲菌等10種(屬)具有高靈敏度和特異性，檢出水平可達(dá)10CFU/mlt251。殷涌光等在使用集成化手持式Spreeta TM SPR傳感器快速檢測大腸桿菌時(shí)，引入膠體金復(fù)合抗體作為二次抗體大幅度增加質(zhì)量，進(jìn)一步擴(kuò)大了檢測信號(hào)，同時(shí)延長膠體金復(fù)合抗體與微生物的結(jié)合過程，使檢測信號(hào)進(jìn)一步穩(wěn)定與放大，從而顯著提高了檢測精度，使該傳感器對大腸桿菌的檢測精度由10.6 CFU/ml提高到10.1CFU/ml。金免疫滲濾法重要的食源性致病菌之一大腸埃希氏菌0157：H7，目前的檢測通常先以山梨醇麥康凱瓊脂(sMAC)進(jìn)行初篩，然后用生化和血清學(xué)試驗(yàn)做鑒定，一般需要24～48h，而采用膠體金免疫滲濾法檢測卻非常的簡便，在很短時(shí)間即可得到結(jié)果。

在致病菌快速檢測中金標(biāo)試紙條的研究越來越廣泛。謝昭聰?shù)葢?yīng)用膠體金免疫層析法檢測水產(chǎn)品中霍亂弧菌的研究中，增菌液霍亂弧菌含量為1CFU/ml，通過增菌12h后，即可應(yīng)用膠體金免疫層析法診斷試劑檢出，而一般水產(chǎn)品霍亂弧菌檢測所采用的傳統(tǒng)常規(guī)方法，檢測時(shí)限長，增菌培養(yǎng)需8～16h，分離培養(yǎng)需14～20h，初步報(bào)告需30h以上，實(shí)際操作中，需要3d以上才能出報(bào)告。腸桿菌科的大屬沙門氏菌可引起人的沙門氏菌性食物中毒，王中民等人采用免疫滲濾法可檢出85%的引起食物中毒的沙門氏菌，靈敏度為2.4×107CFU/ml，對最常見的鼠傷寒、豬霍亂和腸炎沙門氏菌，檢出率達(dá)100%，而采用膠體金免疫層析法的靈敏度為2.1×106CFU/mlt30j。被美國列為七種主要食源性致死病菌之一的李斯特菌，如果按照傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和鑒定技術(shù)需要l～2周時(shí)間，而采用免疫膠體金層析法只需10min就能得到檢測結(jié)果，靈敏度達(dá)到87.5%。

真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌(Fungi)產(chǎn)生的具有毒性的二級代謝產(chǎn)物，廣泛存在食品和飼料中，人類若誤食受污染的食品，就會(huì)中毒或誘發(fā)一定疾病，甚至癌癥。檢測食品中的真菌毒素常用理化方法或生物學(xué)方法。但理化法需要較昂貴的儀器設(shè)備，操作復(fù)雜。而運(yùn)用免疫技術(shù)檢測真菌毒素敏感性高，特異性強(qiáng)，非常適用于食物樣品的檢測。D．J．Chiao等使用金標(biāo)免疫層析法在10min之內(nèi)即可檢測50ng/ml的肉毒桿菌毒素B(BoNT/B)，如果使用銀增強(qiáng)則其檢測限可以達(dá)到50pg/ml，而且對A、E型肉毒桿菌毒素沒有交叉反應(yīng)。貉曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬產(chǎn)生的一類真菌毒素，其中毒性最大、與人類健康關(guān)系最密切、對農(nóng)作物的污染最重、分布最廣的是赭曲霉素A(OTA)，賴衛(wèi)華等研制的赭曲霉毒素A快速檢測膠體金試紙條，檢測限達(dá)到了10ng/mlt331，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于目前我國對赭曲霉毒素的限量要求5μg/L。黃曲霉毒素B z的快速檢測國內(nèi)也有很多研究，孫秀蘭研制的黃曲霉毒素B，金標(biāo)免疫試紙條，其最低檢測限達(dá)到2．5ng/ml，而且能定性或半定量檢測食品中的黃曲霉毒素B，含量。

小 結(jié)

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，食品分析檢測技術(shù)也在不斷地更新、完善和迅速發(fā)展，尤其是快速檢測技術(shù)更能適應(yīng)現(xiàn)代高效、快速的節(jié)奏和滿足社會(huì)的要求。儀器分析法可以保證數(shù)據(jù)的精確性和準(zhǔn)確性，但其流程仍比較煩瑣。盡管以納米金為標(biāo)記物的免疫分析法及其它速測技術(shù)的開發(fā)過程需投入較多資金和較長時(shí)間，但具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、價(jià)廉、樣品所需量少等優(yōu)點(diǎn)，其靈敏度與常規(guī)的儀器分析一致，適合現(xiàn)場篩選，而且其中的金免疫層析技術(shù)正在向定量、半定量檢測和多元檢測的方向發(fā)展，更加體現(xiàn)出金標(biāo)技術(shù)的優(yōu)勢?？傊?，快速檢測技術(shù)的快速、靈敏、簡便等優(yōu)點(diǎn)，使之在食品衛(wèi)生檢疫和環(huán)境檢測中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。

制備方法

配制濃度為2.44×10-3 mol/L 的HAuCl4·4H2O溶液、濃度為3.43×10-2 mol/L 的Na3C6H5O7·2H2O 溶液、濃度為1.00×10-4 mol/L 的 PVP 溶液, 以及濃度為0.391 mol/L 的NaBH4 溶液備用。在燒杯中加入10 mL 氯金酸溶液, 10 mL 或不加保護(hù)劑溶液, 80 mL 三蒸水, 將燒杯置于數(shù)顯測速恒溫磁力攪拌器上, 邊加熱邊攪拌, 攪拌的轉(zhuǎn)速設(shè)置為600 r/min, 加熱至75℃, 恒溫2 min, 用移液管移取一定體積的還原劑(Na3C6H5O7 或NaBH4)溶液，迅速一次加入到上述混合液, 開始計(jì)時(shí), 使液體顏色恒定并持續(xù)加熱一段時(shí)間共9 min, 停止加熱, 繼續(xù)攪拌5 min 后, 停止攪拌, 冷卻至室溫, 所得液體為納米金溶膠。