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生物反應(yīng)器
生物功能模擬機(jī)
生物反應(yīng)器，是指利用自然存在的微生物或具有特殊降解能力的微生物接種至液相或固相的反應(yīng)系統(tǒng)。目前研究得最多的兩種反應(yīng)器是“升降機(jī)型反應(yīng)器”和“土壤泥漿反應(yīng)器”。升降機(jī)型反應(yīng)器是通過(guò)水相的流動(dòng)來(lái)提供適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)、碳源和氧氣，從而達(dá)到降解土壤中污染物質(zhì)的目的。與固相系統(tǒng)相比，生物反應(yīng)器能夠在更短的時(shí)間內(nèi)將污染物進(jìn)行有效降解。該生物反應(yīng)器技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于有機(jī)污染土壤的生物修復(fù)中。
基本信息
| 中文名 | 生物反應(yīng)器 |
| 外文名 | Bioreactor |
| 利用 | 酶或生物體 |
| 性質(zhì) | 醫(yī)學(xué)器械 |
簡(jiǎn)介
生物反應(yīng)器是利用酶或生物體（如微生物）所具有的生物功能，在體外進(jìn)行生化反應(yīng)的裝置系統(tǒng)，它是一種生物功能模擬機(jī)，如發(fā)酵罐、固定化酶或固定化細(xì)胞反應(yīng)器等。在酒類(lèi)、醫(yī)藥生產(chǎn)、濃縮果醬、果汁發(fā)酵、有機(jī)污染物降解方面有重要應(yīng)用。
概述
名稱(chēng)：生物反應(yīng)器
主題詞或關(guān)鍵詞：DNA生命科學(xué)細(xì)菌胰島素
生物反應(yīng)器：生物反應(yīng)器是利用生物體所具有的生物功能，在體外或體內(nèi)通過(guò)生化反應(yīng)或生物自身的代謝獲得目標(biāo)產(chǎn)物的裝置系統(tǒng)、細(xì)胞、組織器官等等。
內(nèi)容
生物反應(yīng)器聽(tīng)起來(lái)有些陌生，基本原理卻相當(dāng)簡(jiǎn)單。胃就是人體內(nèi)部加工食物的一個(gè)復(fù)雜生物反應(yīng)器。食物在胃里經(jīng)過(guò)各種酶的消化，變成我們能吸收的營(yíng)養(yǎng)成分。生物工程上的生物反應(yīng)器是在體外模擬生物體的功能，設(shè)計(jì)出來(lái)用于生產(chǎn)或檢測(cè)各種化學(xué)品的反應(yīng)裝置?；蛘哒f(shuō)，生物反應(yīng)器是利用酶或生物體（如微生物）所具有的生物功能，在體外進(jìn)行生化反應(yīng)的裝置系統(tǒng)，是一種生物功能模擬機(jī)，如發(fā)酵罐、固定化酶或固定化細(xì)胞反應(yīng)器等。
在固定化酶廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)上，人們發(fā)現(xiàn)天然細(xì)胞本身就具有多功能的系列化反應(yīng)系統(tǒng)采用物理或化學(xué)方法將細(xì)胞固定化，是利用酶或酶系的一條捷徑。一個(gè)固定化細(xì)胞反應(yīng)器猶如一臺(tái)“生命活動(dòng)功能推動(dòng)機(jī)”。固定化細(xì)胞技術(shù)開(kāi)始于70年代，其實(shí)際應(yīng)用程度已超過(guò)固定化酶。如美國(guó)、歐洲、日本均采用固定化菌體柱床工藝大規(guī)模生產(chǎn)高果糖漿。
輸卵管
膜生物反應(yīng)器
1994年11月（Glodegg Plan）和1995年3月及1996年轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通訊、1995年7月上海首屆國(guó)際生物技術(shù)與藥物學(xué)術(shù)研討暨展覽會(huì)、1996年11月北京第1屆國(guó)際暨第3屆全國(guó)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物學(xué)術(shù)研討會(huì)（秘書(shū)長(zhǎng)曾邦哲）、1997年生物技術(shù)通報(bào)發(fā)表，并創(chuàng)造了“輸卵管生物反應(yīng)器（oviduct bioreactor）”一術(shù)語(yǔ)與詞匯，以及1999年在德國(guó)創(chuàng)建的系統(tǒng)生物科學(xué)與工程網(wǎng)站闡述了輸卵管生物反應(yīng)器（oviduct bioreactor）概念、方法與技術(shù)研究。
1996年創(chuàng)辦第1屆國(guó)際轉(zhuǎn)基因?qū)W術(shù)研討會(huì)期間，曾邦哲與加拿大、美國(guó)、英國(guó)、日本有關(guān)轉(zhuǎn)基因禽類(lèi)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系，但國(guó)際上當(dāng)時(shí)沒(méi)有人開(kāi)展這項(xiàng)課題，隨后與美國(guó)Avigenics公司和Georgia大學(xué)R.Ivarie教授探討了輸卵管生物反應(yīng)器的合作研究。
1998年，美國(guó)Avigenics公司獨(dú)立開(kāi)展了規(guī)模化投資與研究開(kāi)發(fā)輸卵管生物反應(yīng)器，因中國(guó)科學(xué)家曾邦哲已經(jīng)去了以色列。2002年后，國(guó)際國(guó)內(nèi)掀起了輸卵管生物反應(yīng)器的研究開(kāi)發(fā)熱潮，2003年Science發(fā)表了Gloden Egg的評(píng)述文章。
目前，國(guó)際上已有十多家前景看好的公司以輸卵管生物反應(yīng)器作為拳頭開(kāi)發(fā)產(chǎn)品，約2003年英國(guó)羅斯林研究所也創(chuàng)建了公司，并由Sang博士主持研究課題，從禽類(lèi)蛋黃表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)向了輸卵管生物反應(yīng)器。輸卵管生物反應(yīng)器將稱(chēng)為繼哺乳動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器后最具發(fā)展前景的動(dòng)物生物反應(yīng)器。
基因構(gòu)建
《國(guó)外醫(yī)學(xué)》預(yù)防、診斷、治療用生物制品分冊(cè)1999年第22卷第5期
關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器 藥物 基因構(gòu)建 表達(dá)
摘要 近年來(lái)，生物學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的成就促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的蓬勃發(fā)展。用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白是生物技術(shù)領(lǐng)域里的又一次革命，它以一個(gè)全新生產(chǎn)珍貴藥用蛋白的模式區(qū)別于傳統(tǒng)藥物的生產(chǎn)。本文著重介紹轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的基因構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織特異性表達(dá)的最新進(jìn)展。
生物反應(yīng)器
同源組織
目前，在同源組織中表達(dá)蛋白質(zhì)最典型的例子是在動(dòng)物的紅細(xì)胞中表達(dá)人的血紅蛋白。在人的血紅蛋白基因編碼序列里啟動(dòng)子有2個(gè)CACCC盒，而對(duì)應(yīng)的豬的啟動(dòng)子里只有一個(gè)，另一個(gè)靠近它的是CGCCC盒。Sharma等[1]將豬的β-啟動(dòng)子與人的β編碼基因融合，并將人的β-基因座調(diào)控區(qū)（β-LCR）和α、ε基因與融合基因的β基因連接在一起構(gòu)成載體，轉(zhuǎn)入豬胚胎細(xì)胞，從轉(zhuǎn)基因豬分泌乳汁中得到的重組人血紅蛋白含量高達(dá)32g/L。
生產(chǎn)蛋白
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)重組蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱為靶位。在這些表達(dá)器官中，通過(guò)構(gòu)建合適的載體，選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和調(diào)控序列可產(chǎn)生比正常水平高得多的重組蛋白。不過(guò)，生產(chǎn)系統(tǒng)應(yīng)盡可能與循環(huán)系統(tǒng)隔離，以減少表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主動(dòng)物的影響。
乳腺生物
將所需目的基因構(gòu)建入載體，加上適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，轉(zhuǎn)入動(dòng)物胚胎細(xì)胞，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的乳汁中含有所需要藥用蛋白。從融合基因轉(zhuǎn)入胚胎細(xì)胞到收集蛋白質(zhì)有一個(gè)過(guò)程，包括胚胎植入、分娩和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物從出生到第一次泌乳，豬、羊、牛各需12、14、16個(gè)月；并且只有雌性動(dòng)物泌乳且不連續(xù)，一般可持續(xù)2、6、10個(gè)月。牛、羊等大型家畜能對(duì)藥用蛋白進(jìn)行正確的后加工，使之具有較高的生物活性，同時(shí)產(chǎn)奶量大，易于大規(guī)模生產(chǎn)，因而成為乳腺生物反應(yīng)器理想的動(dòng)物類(lèi)型。
抗凝血酶Ⅲ
第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)物是抗凝血酶Ⅲ，將半乳糖β-酪蛋白的啟動(dòng)子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相連，轉(zhuǎn)入綿羊胚胎細(xì)胞，在轉(zhuǎn)基因綿羊的乳液中得到有生物活性的蛋白產(chǎn)量可達(dá)7g/L[2]。目前該蛋白正用于冠狀動(dòng)脈旁路手術(shù)患者的二期臨床驗(yàn)證。
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中人們發(fā)現(xiàn)牛的β-乳球蛋白（BLG）基因非常穩(wěn)定，并能在乳腺中特異性表達(dá)。Hyttinen等[3]將含有5'端2.8kb和3'端1.9kb的牛BLG基因片段構(gòu)建成載體，轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細(xì)胞，可在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺中特異表達(dá)高水平的BLG，此外，還發(fā)現(xiàn)CpG位點(diǎn)的甲基化程度與BLG的表達(dá)量有關(guān)，甲基化少的轉(zhuǎn)基因小鼠乳液中BLG分泌量較大，可達(dá)1～2mg/ml，而其他轉(zhuǎn)基因小鼠分泌量小于0.1mg/ml。
紅細(xì)胞生成素
生物反應(yīng)器
因子Ⅸ
Schnieke等[6]將羊的BLG基因5'末端和人的因子Ⅸ cDNA 與含有BLG復(fù)制單元和3'末端的片段融合，將構(gòu)建的雜合基因轉(zhuǎn)入羊的胚胎細(xì)胞，從分泌的乳汁中得到125μg/ml的重組蛋白。黃淑幀教授等[7]構(gòu)建了一個(gè)含有小鼠MAR元件、牛β-酪蛋白基因調(diào)控序列和hFⅨ微基因的hFⅨ乳腺組織特異性表達(dá)載體pMCⅨm，其中hF Ⅸ微基因包括全長(zhǎng)hF Ⅸ cDNA ，800bp經(jīng)過(guò)改造的內(nèi)含子1序列和hFⅨ蛋白的信號(hào)肽序列。將線形化的表達(dá)載體pMC Ⅸm導(dǎo)入羊的受精卵。轉(zhuǎn)基因羊分泌的乳汁中hFⅨ蛋白的含量約為95ng/ml。在另一實(shí)驗(yàn)中，Yull等[8]將BLG5'末端序列，fⅨ編碼序列和缺失隱性3'端連接點(diǎn)的f Ⅸ3'末端不翻譯區(qū)域的一個(gè)小片段融合，構(gòu)成雜合基因，去掉SphI和SmaI位點(diǎn)，克隆入移去了pBJ41的SphI/EcoRV。轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細(xì)胞，得到的重組蛋白產(chǎn)量達(dá)0.06mg/ml。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺中對(duì)DNA的錯(cuò)誤剪切使分泌量降低，從而增高重組蛋白產(chǎn)率。在乳腺組織中表達(dá)有完全活性的因子Ⅸ是比較成功的，尤其是乳腺組織對(duì)因子Ⅸ N端附近的一段含12個(gè)葡萄糖殘基的序列進(jìn)行γ-羧化以保持其活性，而在以前的天然蛋白中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)γ-羧化作用。
因子Ⅷ
人FⅧcDNA長(zhǎng)約7.2kb，是目前為止表達(dá)的最長(zhǎng)cDNA。將它插入小鼠的乳清酸性蛋白（WAP）基因中啟動(dòng)子（2.5kb）的下游，使之在乳腺中靶向分泌FⅧ重組蛋白。在WAP/FⅧcDNA構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠中rFⅧ表達(dá)最低，而在轉(zhuǎn)基因豬中可達(dá)1.0～2.7μg/ml[9]。
單克降抗體
Castilla等[10]將編碼了重組單克降抗體（rMab）6A.C3的免疫球蛋白基因cDNA插入小鼠WAP dNA基因組的第一個(gè)外顯子，使rMab 6A.C3的表達(dá)可以由WAP基因調(diào)控序列來(lái)控制，將構(gòu)建的雜合基因注入小鼠胚胎細(xì)胞原核，使小鼠乳腺分泌有活性的單克降抗體，這種轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物將廣泛應(yīng)用于預(yù)防新生兒腸道感染。
C蛋白
同樣在WAP基因的第一個(gè)外顯子位點(diǎn)，Drews等[11]將人C蛋白cDNA插入，轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細(xì)胞，可得到產(chǎn)量達(dá)1.6mg/ml的重組蛋白。而將上述雜合基因轉(zhuǎn)入豬的胚胎細(xì)胞，可使豬分泌出380μg/mlμg/ml·hr的外源蛋白，活性與人血漿中C蛋白的活性相同。由于C蛋白的抗凝活性依賴(lài)于輕鏈膜結(jié)合區(qū)域正確的γ-羧化，因此，轉(zhuǎn)基因豬能分泌有活性的C蛋白表明豬的乳腺細(xì)胞可對(duì)C蛋白前體高速率地進(jìn)行γ-羧化，以使成熟C蛋白有完整的活性。
優(yōu)點(diǎn)
1.成本低
2.設(shè)備簡(jiǎn)單
3.效率高
4.產(chǎn)品作用效果顯著
5.減少工業(yè)污染
應(yīng)用
1.改良乳汁品質(zhì)；
2.生產(chǎn)藥用蛋白。
3.外源基因在動(dòng)物體內(nèi)的位點(diǎn)整合問(wèn)題；
4.乳蛋白基因表達(dá)組織特異性問(wèn)題；
5.目的蛋白的翻譯后修飾問(wèn)題；
6.轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化問(wèn)題；
7.轉(zhuǎn)基因的技術(shù)與方法問(wèn)題；
膀胱生物反應(yīng)器
膀胱反應(yīng)器有著和乳腺反應(yīng)器一樣的優(yōu)點(diǎn)：收集產(chǎn)物蛋白比較容易，不必對(duì)動(dòng)物造成傷害。此外，該系統(tǒng)可從動(dòng)物一出生就收集產(chǎn)物，不論動(dòng)物的性別和是否正處于生殖期。膀胱生物反應(yīng)器最顯著的優(yōu)勢(shì)在于從尿中提取蛋白質(zhì)比在乳汁中提取簡(jiǎn)便、高效。
膀胱生物反應(yīng)器多用Uroplakin啟動(dòng)子啟動(dòng)人生長(zhǎng)激素（hGH）的表達(dá)，產(chǎn)生 hGH特異性的高豐度RNA，這些RNA與蛋白分泌量高度相關(guān)。Uroplakin基因在多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)有很高的保守性，如鼠、兔、牛、羊和人等。
生長(zhǎng)激素 Kerr等[12]將pUPII-LacI用質(zhì)粒的Kpn i進(jìn)行消化，用T4DNA多聚酶切去3'端，然后用BamHI消化，分離出3.6kb的5'端小鼠UPII基因片段，此片段含有膀胱反應(yīng)器特異性表達(dá)所需的大部分序列。將此片段與位于無(wú)啟動(dòng)子的pOGH質(zhì)粒純化SaI和BamHI位點(diǎn)間的hGH結(jié)構(gòu)基因的5'端連接，得到pUPII-hGH質(zhì)粒，能表達(dá)該質(zhì)粒的組織分布有限。將得到的pUPII- hGH質(zhì)粒用HindIII和EcoRI消化，得出一段5.7kb的UPII-hGH融合基因可用于顯微注射，在膀胱上皮細(xì)胞中合成hGH，收集轉(zhuǎn)基因動(dòng)物尿液，從中提取重組蛋白。但在這一途徑中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物會(huì)因hGH的作用逐漸肥胖，并導(dǎo)致雌性動(dòng)物不育癥。乳腺生物反應(yīng)器也能表達(dá)hGH。用同源重組方法將hGH基因?qū)?10kb的人α-乳球蛋白位置依賴(lài)性YAC載體，將重組的YAC dNA顯微注入大鼠胚胎，轉(zhuǎn)基因大鼠的乳汁中含有高水平的hGH，含量可達(dá)0.25～8.9mg/ml[13]。
翻譯與修飾
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的蛋白，特別是糖鏈成分的結(jié)構(gòu)與人體蛋白有差異。因此研究分泌蛋白的修飾就顯得很重要。在乳腺生物反應(yīng)器中，蛋白質(zhì)翻譯前修飾的主要方式是在多個(gè)位點(diǎn)對(duì)乳腺中的蛋白前體進(jìn)行信號(hào)肽剪切和對(duì)糖鏈進(jìn)行修飾。例如，從山羊乳液中得到的長(zhǎng)效組織型纖溶酶原激活劑與人體內(nèi)和相比較，含有少量的異種（外源）低聚糖，同時(shí)，唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺和半乳糖含量明顯減少，關(guān)且出現(xiàn)缺少蛋白質(zhì)C127的N-乙酰半乳糖胺。此外，從豬乳液中得到的C蛋白中是沒(méi)有的；從羊乳液中得到的重組α1-抗胰蛋白酶多聚肽也反映了唾液酸酸化程度的差異；在山羊乳腺中觀察到了重組抗凝血酶Ⅲ上低聚甘露糖與特異天冬酰胺的位點(diǎn)特異性聚合等等。研究小鼠乳液中的重組γ-干擾素可對(duì)翻譯前修飾有更好的理解，γ-干擾素有大量的位點(diǎn)特異性變化，在N端連接位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)雜的唾液酸酸化和連接核心巖藻多聚糖，其次是低聚甘露糖。與從小鼠細(xì)胞中取得的蛋白質(zhì)相比，分泌的重組蛋白沒(méi)有GalNAc、NeuGC和Gal∞l 、3Gal-βl、 4GlcNAc殘基。這些蛋白特異性的糖基化類(lèi)型可與細(xì)胞上的受體結(jié)合并清除病人體內(nèi)的重組蛋白，因此可能會(huì)影響療效，最終的結(jié)果尚有待驗(yàn)證。
同源組織表達(dá)蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控并校正珠蛋白鏈的翻譯過(guò)程，避免無(wú)效的翻譯前修飾，使產(chǎn)物蛋白盡可能與人體天然蛋白相似，降低人體內(nèi)的排斥反應(yīng)，提高藥物蛋白療效。目前，蛋白分離技術(shù)飛速發(fā)展，大大提高了蛋白質(zhì)分離的可行性和分離效率。第二種技術(shù)路線中目前以乳腺生物反應(yīng)器較為多見(jiàn)，因?yàn)槿橹椎玫?，且乳汁中的特異蛋白含量較大，對(duì)蛋白水解酶的降解作用也比較穩(wěn)定。乳汁是一種混合物，含3%～6%的總蛋白，3%～5%的脂類(lèi)，對(duì)蛋白提純技術(shù)要求比較高。另一方面，藥用蛋白是在動(dòng)物乳腺中產(chǎn)生。因此只有含轉(zhuǎn)基因型人雌性動(dòng)物在泌乳期才能生產(chǎn)藥用蛋白，可用的動(dòng)物數(shù)目有限，且生產(chǎn)期較短。膀胱生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)在于含有轉(zhuǎn)基因型的兩性動(dòng)物都可用，產(chǎn)后收集時(shí)間長(zhǎng)，提取產(chǎn)物蛋白濃度雙乳液中的含量低得多，盡管收集的尿液多且時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)單位數(shù)量的藥用蛋白在乳腺和膀胱生物反應(yīng)器中的成本是差不多的
問(wèn)題與展望
在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的應(yīng)用中，有些問(wèn)題尚待解決。比如，由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因是鑲嵌整合型的，因此它的下一代并不都轉(zhuǎn)基因型。但是在綿羊，豬和山羊中觀察到只要轉(zhuǎn)基因型從起始個(gè)體傳給了下一代，這種轉(zhuǎn)基因型就可以穩(wěn)定地遺傳好幾代。而其他一些因素，如外源基因的整合率低，胚胎移植的受孕率低等都使有效的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大大減少。同時(shí)，由于對(duì)調(diào)控表達(dá)水平的程序，指導(dǎo)進(jìn)行精確的組織特異性和發(fā)育調(diào)控表達(dá)的程序，以及調(diào)控和編碼內(nèi)含子序列間可能的相互作用的認(rèn)識(shí)尚不充分[14]，容易引起異位點(diǎn)表達(dá)；由于現(xiàn)在的技術(shù)還不能控制整合的位點(diǎn)，因此存在對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行插入誘變的可能性，轉(zhuǎn)基因型的表達(dá)會(huì)受整合的不同位點(diǎn)的影響。這些因素使得在家畜長(zhǎng)成前，要用小鼠對(duì)新基因構(gòu)型進(jìn)行常規(guī)試驗(yàn)。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的藥用蛋白可用于預(yù)防和治療疾病，其轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及口服用藥引起的耐受性等問(wèn)題都在作進(jìn)一步研究。以轉(zhuǎn)基因家畜生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益，這項(xiàng)生物技術(shù)最終將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。
發(fā)展階段
生物反應(yīng)器（bioreactor）經(jīng)歷了三個(gè)發(fā)展階段：細(xì)菌基因工程、細(xì)胞基因工程、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的出現(xiàn)之所以受到人們極大的關(guān)注，是因?yàn)樗朔饲皟烧叩娜毕?，即?xì)菌基因工程產(chǎn)物往往不具備生物活性，必須經(jīng)過(guò)糖基化、羥基化等一系列修飾加工后才能成為有效的藥物，而細(xì)胞基因工程又因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件要求相當(dāng)苛刻、成本太高而限制了規(guī)模生產(chǎn)。另外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器還具有產(chǎn)品質(zhì)量高、容易提純的特點(diǎn)。一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫做動(dòng)物生物反應(yīng)器。幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可以經(jīng)過(guò)人為馴化為生物反應(yīng)器。從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織或器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器、動(dòng)物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器
用微生物、植物、動(dòng)物或人細(xì)胞，或者用專(zhuān)一性酶通過(guò)生物方法將原料轉(zhuǎn)化為特定產(chǎn)品的容器稱(chēng)為生物反應(yīng)器。通常微生物和細(xì)胞又涉如何維持它們的環(huán)境以提供最佳的生長(zhǎng)條件的問(wèn)題。生物反應(yīng)器能通過(guò)提供合適的條件：例如最佳溫度、pH、有效的底物、營(yíng)養(yǎng)鹽、維他命和氧（對(duì)好氧有機(jī)物）來(lái)支持這個(gè)自然過(guò)程，使細(xì)胞能進(jìn)行生長(zhǎng)和新陳代謝。生物反應(yīng)器（bioreactor) 經(jīng)歷了3 個(gè)發(fā)展階段細(xì)菌基因工程、細(xì)胞基因工程、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器。細(xì)胞基因工程產(chǎn)物往往不具備生物活性，必須經(jīng)過(guò)糖基化、羥基化等一系列修飾加工后，才能成為有效的藥物，而細(xì)胞基因工程又因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件要求相當(dāng)苛刻，成本太高，限制了規(guī)模生產(chǎn)。動(dòng)物生物反應(yīng)器具有產(chǎn)品質(zhì)量高，容易提純的特點(diǎn)，彌補(bǔ)了其它各類(lèi)基因表達(dá)系統(tǒng)的缺陷。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器
利用基因工程培育新型微生物
等。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物最為誘人的前景是利用它生產(chǎn)人類(lèi)所需要的生物活性產(chǎn)品或藥物。目前世界上有很多公司正在致力于這方面的研究。而轉(zhuǎn)基因家畜研究最為活躍的領(lǐng)域就是利用它們生產(chǎn)新的動(dòng)物產(chǎn)品。通常把目的基因在血液循環(huán)系統(tǒng)或乳腺中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物稱(chēng)為動(dòng)物生物反應(yīng)器，把家畜作為一種生物反映器，生產(chǎn)人類(lèi)所需的藥用蛋白，包括治療用藥物、激素和抗體等。
動(dòng)物血液生物反應(yīng)器
近年來(lái)，動(dòng)物血液生物反應(yīng)器取得了很大進(jìn)展。血液生物反應(yīng)器比較適合生產(chǎn)人血紅蛋白、抗體和生產(chǎn)非生物學(xué)活性狀態(tài)的融合蛋白，而有活性的蛋白或多肽（如激素、細(xì)胞分裂素、組織血纖維溶酶因子等）由于進(jìn)入了動(dòng)物血液循環(huán)系統(tǒng)而影響動(dòng)物的健康。到目前為止，已有多種通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的具有生物學(xué)功能的人血紅蛋白問(wèn)世。
動(dòng)物的乳腺生物反應(yīng)器
乳腺生物反應(yīng)器的原理是外源基因在乳腺特異性表達(dá)需要乳蛋白基因的一個(gè)啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)，即引導(dǎo)泌乳蛋白基因表達(dá)的序列，將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列之下，使之在乳腺中表達(dá)，通過(guò)回收乳汁獲得重要價(jià)值的生物活性蛋白。從目前的研究成果看，與傳統(tǒng)的原核系統(tǒng)及細(xì)胞發(fā)酵系統(tǒng)相比，動(dòng)物乳腺生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品具有以下特點(diǎn)：生物活性高，無(wú)污染，純化簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高，成本低。目前，已克隆并用作構(gòu)建載體的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因[2]。大多數(shù)的乳蛋白基因的啟動(dòng)子已用于外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺中的表達(dá)。s1-酪蛋白基因和-乳球蛋白的啟動(dòng)子尚有未知因素的作用，它們?cè)谵D(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)水平低或表達(dá)不穩(wěn)定。-酪蛋白的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)水平也很低。綿羊-乳球蛋白、山羊酪蛋白和牛s1-酪蛋白啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺中維持異種蛋白的表達(dá)水平較高。如果得用目的基因的DNA序列而不是cDNA，表達(dá)效果可能會(huì)更好。不翻譯的外顯子和內(nèi)含子的摻入可能有利于
轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。值得一提的是，利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的“新奇牛奶”已經(jīng)問(wèn)世。2003 年，Brophy 等通過(guò)共轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選向牛胎兒成纖維細(xì)胞引入-s蛋白基因和-酪蛋白基因的多量拷貝，而后進(jìn)行核移植生產(chǎn)出了8 頭轉(zhuǎn)基因奶牛，其產(chǎn)奶中酪蛋白總量較普通奶高30%。這種奶的蛋白和鈣含量提高，熱穩(wěn)定性增強(qiáng)而乳糜顆粒變小，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，也更適于奶酪生產(chǎn)[3]。
優(yōu)越性
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的問(wèn)世，為利用基因工程手段獲得低成本、高活性和高表達(dá)的產(chǎn)物開(kāi)辟了一條重要途徑。作為生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，主要是利用其乳腺組織和血液組織進(jìn)行定位表達(dá)，特別是用乳腺組織生產(chǎn)具有生物活性的多肽藥物和具有特殊營(yíng)養(yǎng)意義的蛋白質(zhì)，已成為一個(gè)新興的轉(zhuǎn)基因制藥業(yè)，它的優(yōu)越性有如下幾點(diǎn)[4]。3.1 表達(dá)產(chǎn)物能充分修飾且具有穩(wěn)定的生物活性 利用DNA重組技術(shù)的微生物發(fā)酵工程來(lái)生產(chǎn)的藥用蛋白，由于細(xì)菌等微生物不能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成后的加工，因而生物活性低，并且具有免疫原性，而利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥用蛋白卻免除這些問(wèn)題。
成本低可以大規(guī)模生產(chǎn)
作為生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可無(wú)限擴(kuò)繁，且飼養(yǎng)成本低，可進(jìn)行大規(guī)模的藥物生產(chǎn)。而動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器，雖然能生產(chǎn)具有完全生物活性的產(chǎn)品，但以商業(yè)生產(chǎn)為目的的大規(guī)模的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，成本會(huì)極高且培養(yǎng)條件要求苛刻。
產(chǎn)品質(zhì)量高易提純
由動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的藥品為純的生物制品，避免了化學(xué)試劑及生物毒素的污染。目前，某些藥用蛋白生產(chǎn)已達(dá)每千克乳汁含幾十克，生物活性與天然蛋白幾乎完全一樣，極易提純?？傊?，動(dòng)物生物反應(yīng)器彌補(bǔ)了其它各類(lèi)基因表達(dá)系統(tǒng)的缺陷。
應(yīng)用
以動(dòng)物的乳腺或其它組織作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)貴重的醫(yī)用蛋白，是動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的另一特殊形式。由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，并能穩(wěn)定地遺傳給后代，外源基因不僅能在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物得到整合和表達(dá)，而且能獲得組織特異性（乳腺組織）和發(fā)育特性（妊娠后期和泌乳期）表達(dá)，利用這一點(diǎn)能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因泌乳家畜，還能生產(chǎn)出目前短缺而又十分珍貴的醫(yī)用蛋白。近十年，這方面的研究在英、美、法、瑞士和荷蘭等國(guó)家已相繼展開(kāi)，并取得了一定進(jìn)展。截至目前，世界一些國(guó)家的生物技術(shù)企業(yè)在利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作生物反應(yīng)器研究開(kāi)發(fā)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物藥品有以下幾種。
組織纖溶酶原激活劑（TPA）：由美國(guó)遺傳技術(shù)公司（Genentech) 用基因重組技術(shù)開(kāi)發(fā)的血栓溶解劑，1987 年11 月經(jīng)聯(lián)邦食品及藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)上市。1988 年的銷(xiāo)售額為1.5 ～ 1.6 億美元，1989年為1.8 ～ 1.9 億美元。今后每年的市場(chǎng)銷(xiāo)售額約為2 ～ 2.5 億美元。
乳鐵蛋白（lactoferrin): 用轉(zhuǎn)基因奶牛生產(chǎn)。由于以轉(zhuǎn)基因奶牛生產(chǎn)乳鐵蛋具備產(chǎn)量高、成本低，以及有無(wú)限量增殖生化反應(yīng)器等特征，因而備受各國(guó)矚目。乳鐵蛋白是一種口服的活性蛋白，自然產(chǎn)生于人乳中，它具有抗菌、傳遞鐵素等特性。
人類(lèi)-1 抗胰蛋白酶（AAT）：-1 抗胰蛋白酶（AAT）缺乏是最常見(jiàn)的遺傳代謝病，能引起肺和肝的損傷。-1 抗胰蛋白酶（AAT）為呼吸系統(tǒng)的非特異性可溶因子，它可抑制多種酶的活性，包括細(xì)菌的酶，以及中性白細(xì)胞溶酶體分泌的蛋白質(zhì)、彈性蛋白酶、膠原酶、纖維蛋白溶酶和凝血酶。這項(xiàng)產(chǎn)品是從英國(guó)農(nóng)業(yè)和食品研究委員會(huì)的動(dòng)物生理和遺傳研究院（IAPGR）研究成果為基礎(chǔ)，近年由英國(guó)PPL 公司與德國(guó)拜耳公司共同嘗試用轉(zhuǎn)基因綿羊的羊奶生產(chǎn)AAT。
促紅細(xì)胞生成素(EPO）：以轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)。這種藥物存于轉(zhuǎn)基因豬的血液中。目前轉(zhuǎn)基因豬血球素合成的遺傳控制機(jī)制已十分清楚，用基因重組技術(shù)合成的EPO 已在多個(gè)國(guó)家上市。
重組人抗凝血酶ii（i atryn）：世界上第一個(gè)動(dòng)物乳腺生物反映器重組蛋白藥物。Atryn的主要成分-重組人抗凝血酶iii 具有抑制血液中凝血酶活性，預(yù)防和治療急慢性血栓血塞形成，對(duì)治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。拒美國(guó)權(quán)威機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)，到2010年，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷(xiāo)售額將達(dá)到350 億美元，生產(chǎn)的藥物將占整個(gè)基因工程藥物種類(lèi)的90%以上。
存在的問(wèn)題與發(fā)展前景
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與生物反應(yīng)器是20 世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展的一個(gè)里程碑，但現(xiàn)在仍然存在著許多急需解決的問(wèn)題。由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究在理論和技術(shù)上尚有不完善之處，使得轉(zhuǎn)入的外源基因在動(dòng)物基因組中隨機(jī)整合、調(diào)節(jié)失控、遺傳不穩(wěn)定，表達(dá)率不高。要提高轉(zhuǎn)基因的效率，保證外源基因的有效表達(dá)，關(guān)鍵是基因構(gòu)建的定點(diǎn)整合。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的產(chǎn)品的安全性問(wèn)題。這包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)物的分離和提純，表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和生物活性與人體蛋白的相似性的問(wèn)題。只有從表達(dá)產(chǎn)物除去能引起人類(lèi)變態(tài)反應(yīng)的非人類(lèi)蛋白，并且產(chǎn)品與人體蛋白有足夠的相似性，才能應(yīng)用于人類(lèi)的健康事業(yè)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成活率低，出生后的部分個(gè)體表現(xiàn)出各種生理和免疫缺陷。如為提高生產(chǎn)性能而制備的轉(zhuǎn)基因豬出現(xiàn)了雌性不育、胃潰瘍和關(guān)節(jié)炎等病癥；而克隆牛已經(jīng)先后死去；轉(zhuǎn)基因后獲得的目的性狀，通過(guò)有性繁殖后，遺傳性狀出現(xiàn)分離，如英國(guó)的一只高產(chǎn)1-AT 羊奶的轉(zhuǎn)基因綿羊，其子代羊奶中的含僅為其母親的1/10[6]。盡管轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的研究仍面臨著許多需要解決的問(wèn)題，但它
潛在的社會(huì)價(jià)值是無(wú)可估量的。在未來(lái)幾年內(nèi)，將有多種動(dòng)物乳腺生物反映器重組蛋白上市，從而形成市場(chǎng)前景廣闊和利潤(rùn)巨大的新生物制藥行業(yè)。
工程
生物反應(yīng)器是使生物反應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)的裝置。生物反應(yīng)器有各種各樣的形式，要使生物反應(yīng)器運(yùn)行得好，必須首先對(duì)生物反應(yīng)器和反應(yīng)特征有深刻的理解，這就是生物反應(yīng)器工程的概念。生物反應(yīng)器工程著重研究生物反應(yīng)器本身的特性，如其結(jié)構(gòu)和操作方式、操作條件對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成的關(guān)系。它與生物反應(yīng)工程結(jié)合，共同解決各種生物反應(yīng)的最佳生物反應(yīng)器、最佳操作條件的選擇問(wèn)題。
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